酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）分布极广泛，遍布各种组织，主要存在于细胞的溶酶体内，所以常作为溶酶体标志酶，溶酶体外的酸性磷酸酶存在于内质网和胞质内，各种动物中的酸性磷酸酶各有不同，酸性磷酸酶的适宜pH为4.5～5.5。酸性磷酸酶是一个蛋白家族，哺乳动物中其分子量从18kD到100kD不等，该酶分为两类，一类为酒石酸盐敏感型，一类为氟离子敏感型。溶酶体中的酸性磷酸酶为酒石酸盐敏感型，而红细胞和巨噬细胞中的酸性磷酸酶为氟离子敏感型。血浆中的酸性磷酸酶活性范围2～7.9U/L，血清中酸性磷酸酶的活性范围在2.5～11.7U/L，精液（semen）中含有高浓度的酸性磷酸酯酶，活力可以达到87～436KU/L。
检测原理：Para-nitrophenyl phosphate（pNPP）为一种常用的磷酸酶显色底物，在酸性条件下，可在酸性磷酸酶的作用下生成p-nitrophenol，在碱性条件下p-nitrophenol呈黄色，产物黄色越深说明酸性磷酸酶活性越高，反之则酶活性越低，通过测定400～415nm处吸光度，据此通过比色分析就可以计算出酸性磷酸酶活性水平。
适用样本：细胞或组织的裂解液或匀浆液、血浆、血清、尿液等
自备仪器和试剂
- 酶标仪（能测410nm处的吸光度）
- 96孔板、可调节式移液枪及枪头、离心管
- 离心机、水浴锅或恒温箱
操作步骤（仅供参考）
1、样品准备
1.1 血浆、血清和尿液样品
血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于该试剂盒的测定，尿液通常也可以直接用于测定，-20℃冻存，用于酸性磷酸酶的检测。
1.2 细胞或组织样品
取恰当细胞或组织裂解液，如果有必要可用PBS或生理盐水进行适当匀浆，一般细胞数量在10⁶以上，组织应在100mg以上，3000~4000g离心取上清，-20℃冻存，用于酸性磷酸酶的检测。
1.3 植物样品
取适量的植物组织加入少量生理盐水或PBS，充分捣碎或研磨，静置30min，用纱布或滤纸过滤，4000g离心20min，留取上清液并测量体积，-20℃冻存，用于酸性磷酸酶的检测。
1.4 高活性样品
如果样品中含有较高活性的酸性磷酸酶，可以使用原有的裂解液或PBS等进行稀释，也可以采用ACP Assay Buffer稀释。
2、显色工作液配制
取出1支pNPP，恢复至室温后溶解于2.5mL ACP Assay Buffer，混匀，冰上预冷备用，新配制的显色工作液应在6h内用完。
3、标准品工作液配制
取出p-nitrophenol (10mM) 恢复至室温后，取10μL溶解于190μL ACP Assay Buffer，使浓度达到0.5mM，即获得p-nitrophenol (0.5mM)，该试剂-20℃保存2周有效。用p-nitrophenol (0.5mM) 按下表继续稀释标准品：
加入物 (μl) | Std.1 | Std.2 | Std.3 | Std.4 | Std.5 | Std.6 |
ACP Assay Buffer | 90 | 80 | 60 | 50 | 20 | 0 |
p-nitrophenol (0.5mM) | 10 | 20 | 40 | 50 | 80 | 100 |
p-nitrophenol浓度 (μM) | 50 | 100 | 200 | 250 | 400 | 500 |
4、ACP加样
按照下表设置对照孔、标准孔、测定孔，溶液应按照顺序依次加入，并注意避免产生气泡。如果样品中的酸性磷酸酶活性过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定，样品的检测最好能设置平行孔。
加入物 (μl) | 对照孔 | 标准孔 | 测定孔 |
ACP Assay Buffer | 40 | — | — |
标准品工作液（Std.1-6） | — | 40 | — |
待测样品 | — | — | 40 |
显色工作液 | 40 | 40 | 40 |
混匀，37℃孵育25～30min。
Stopping Solution | 160 | 160 | 160 |
5、ACP测定
以对照调零，酶标仪测定410nm处标准孔、测定孔的吸光度（记为A标准、A测定）；如果无法检测410nm，亦可检测400～415nm范围内吸光度，一般15min内检测完毕。
6、结果计算
酸性磷酸酶活性单位的定义：在pH4.8的缓冲液中，37℃条件下，每分钟水解para-nitrophenyl phosphate显色底物产生1微摩尔p-nitrophenol所需的酸性磷酸酶的量定义为一个酶活力单位。
加入40 μL的1号标准管物质时，其酶活力单位为50uM/20min=2.5U/L，依次类推，加入浓度分别为100μM、200μM、250μM、400μM、500μM的p-nitrophenol，活力依次为5、10、12.5、20、25U/L。
以酶活力为横坐标，以对应的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，根据酶活性定义计算出样品中的酸性磷酸酶活性。
注意事项
1、待测样品中不能含有磷酸酶抑制剂，同时需避免反复冻融。
2、建议每次测定时都做标准曲线，以使标准更准确，另外标准品需避免反复冻融。
3、如果没有酶标仪，也可以使用普通的分光光度计测定，但应考虑根据比色杯的最小检测体积，尽量采用小体积的比色杯。
4、所测样品的值高于标准曲线的上限，应用ACP Assay Buffer稀释样品后重新测定。
5、1支显色工作液配制后需当日使用完毕，因此请注意适当多准备一些样品一起检测。
6、p-nitrophenol溶液对人体有害，反应终止液有腐蚀性，请小心操作。
7、如果希望进行酶活性的绝对定量，进行酶反应时应精确计时，此时推荐采用孵育30min或更长时间，以减小操作过程中的时间误差。
8、待测样品中酸性磷酸酶活性较低时，可适当延长孵育时间至60min。
ZJ26F1040016
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