过氧化物酶（Peroxidase，典型如辣根过氧化物酶 HRP）是一类广泛存在于生物体内的氧化还原酶，在细胞氧化应激、能量代谢及免疫反应等过程中发挥关键作用。因此，过氧化物酶活性水平是评价机体氧化还原状态与细胞代谢功能的重要指标，在代谢研究、药物研发及临床检测中具有重要应用价值。此外，过氧化物酶因具有高催化效率与稳定性，被广泛应用于酶联免疫吸附实验（ELISA）、免疫印迹（Western Blot）及生物传感器开发等领域，其活性的精准定量在产品开发与质量控制中同样至关重要。

本试剂盒采用高灵敏度的 Amplex Red 荧光探针检测过氧化物酶活性。在过氧化氢（H₂O₂）存在下，过氧化物酶可催化 Amplex Red 与 H₂O₂ 以 1:1 摩尔比发生定量氧化反应，生成强荧光产物试卤灵（Resorufin）。通过检测试卤灵荧光强度（560 nm 激发、590 nm 发射）或吸光度（A560），即可实现过氧化物酶活性的高灵敏定量检测，信号强度与过氧化物酶活性成正比。

本试剂盒可采用吸光度和荧光两种方法进行检测，具有检测灵敏度高、线性范围宽、样品用量少等特点。在样品体积为 50 µL 时，采用吸光度法检测在 0.05-0.8 mU/mL 浓度范围内有良好的线性关系；采用荧光法检测在 0.05 - 0.4 mU/mL 浓度范围内有良好的线性关系。

A1522298	组分	物理外观	500 T	1000 T	储存条件
A1522298A	辣根过氧化物酶	液体	0.02 mL	0.05 mL	-20℃.避光.
A1522298B	Amplex Red	液体	0.5 mL	1.0 mL	-20℃.避光.
A1522298C	过氧化氢溶液 (3%)	液体	0.4 mL	0.8 mL	-20℃.避光.
A1522298D	检测缓冲液 (20×)	液体	5 mL	10.0 mL	-20℃..

使用方法

1. 储备液配制

1) 将20× 反应液、10 mM Amplex Red 储备液、50 U/mL HRP 冰上解冻，使用前平衡到室温。

2) 将20× 反应液用去离子水按照 1:19 稀释为 1× 反应液备用。

3) 10 mM Amplex Red 为液体储备液，可直接使用,也可稀释成1mm用于后续体积换算方便使用。

4) 50 U/mL HRP 为液体储备液，直接使用剩余酶液分装单次用量，-20°C 冻存。直接使用。

5) 20 mM 过氧化氢（H₂O₂）工作液

用 1× 反应缓冲液稀释约 3% H₂O₂至所需浓度，实际浓度以瓶身为准。

示例：将 22 μL 3%（0.91 M）H₂O₂ 加入 978 μL 1× 缓冲液，得到 20 mM 工作液。

注：稳定型 3% H₂O₂ 储备液降解较慢，但 20 mM 工作液稳定性下降，配制后数小时内用完。

2.标准品配制（浓度 0–2 mU/mL）

1) 标准品配制（浓度 0-2.0 mU/mL，中间母液 100 mU/mL）

2) 用1× 反应液将 50 U/mL HRP 稀释为 100 mU/mL 中间母液。

3) 按下列浓度直接配制标准品（不必倍比稀释，直接配更准）：0，0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，2.0 mU/mL,所有标准品均用1× 反应液稀释定容。。

4) 每次实验请使用新配制的标准品。样品与标准品使用相同稀释液，减小误差。

3. 样本制备

推荐使用新鲜样本，若不立即实验，-80℃可保存 1 个月，使用时冰上解冻。

1) 动物组织用冷 PBS 清洗组织，尽可能去除血液。吸干水分，称取 0.1 g，加入 1 mL 预冷的1× 反应液，冰浴匀浆。10000 g，4℃离心 5 min，取上清置冰上待测。

2) 植物组织称取约 0.1 g 样本，加入 1 mL 预冷的1× 反应液捣碎，冰浴超声破碎 5 min（功率 20% 或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30 次），10000 g，4℃离心 5 min，取上清置冰上待测。

3) 细胞（菌）收集 5×10⁶ 个细胞或细菌，用冷 PBS 清洗后，加入 0.1 mL 预冷的1× 反应液冰浴匀浆或超声破碎 5 min。12000 g，4℃离心 5 min，取上清置冰上待测。

4) 血浆、血清、尿液等生物体液去除蛋白后取上清：可使用 10 kDa 超滤管过滤取滤液；或将样本：30% ZnSO₄溶液 = 20:1 混合涡旋，10000 g 室温离心 5 min，取上清。

4. 检测工作液配制

按需现配现用，冰浴避光保存：

配制含 160 μM Amplex Red + 0.4 mM H₂O₂ 的工作液：

1) 1 mM Amplex Red 储备液：160 μL

2) 20 mM H₂O₂ 工作液：20 μL

3) 1× 反应缓冲液：820 μL

4) 总体积 1 mL，约 20 次反应；终浓度减半。

5. 样本中过氧化物酶活性测定

1) 按以下体系加样：

试剂	标准孔	测定孔
标准品	50 μL	/
样品	/	50 μL
检测工作液	50 μL	50 μL

2) 反应体系充分混匀后25℃避光孵育 20-30 min。吸光度法检测，读取A560；如果是荧光法检测，设置激发波长560nm，发射波长590nm进行荧光强度检测。

6. 结果计算

建立标准曲线时，需要减去空白孔，对照设无 HRP 空白对照。

ΔA _标准 = A_标准− A_空白
ΔA _测定= A _测定 − A_空白

以标准品浓度为横坐标，ΔA 为纵坐标绘制标准曲线，计算样品过氧化物酶活性。

注意事项

1) Amplex Red 试剂光敏、易氧化，全程避光，开瓶 / 配制后尽快使用。

2) 过氧化物酶浓度过高会导致信号下降，样品需提前稀释。

3) H₂O₂ 工作液不稳定，必须现配现用。

4) 反应体系避免含 DTT、2 - 巯基乙醇等还原剂，否则干扰检测。

5) 每次实验均需重新配制标准品并做标准曲线。

Peroxidase (e.g., Horseradish Peroxidase, HRP) is a ubiquitous oxidoreductase in living organisms that plays critical roles in cellular oxidative stress, energy metabolism, and immune responses. Therefore, peroxidase activity serves as a key indicator for evaluating cellular redox status and metabolic function, with important applications in metabolic research, drug discovery, and clinical diagnostics. Furthermore, due to its high catalytic efficiency and stability, peroxidase is widely used in enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), Western Blot, and biosensor development. Accurate quantification of peroxidase activity is essential for product development and quality control.

This kit utilizes the highly sensitive Amplex Red fluorescent probe to detect peroxidase activity. In the presence of hydrogen peroxide (H₂O₂), peroxidase catalyzes the stoichiometric 1:1 oxidation reaction between Amplex Red and H₂O₂ to produce the strongly fluorescent product resorufin. Sensitive quantification of peroxidase activity is achieved by measuring resorufin fluorescence (excitation at 560 nm, emission at 590 nm) or absorbance at 560 nm (A560). Signal intensity is proportional to peroxidase activity.

The kit supports both absorbance and fluorescence detection, featuring high sensitivity, wide linear range, and low sample consumption. With a sample volume of 50 µL:

Absorbance assay: good linearity from 0.05 to 0.8 mU/mL
Fluorescence assay: good linearity from 0.05 to 0.4 mU/mL.

A1522298	Components	Appearance	500 T	1000 T	Storage conditions
A1522298A	Horseradish Peroxidase	Liquid	0.02 mL	0.05 mL	-20℃.dark.
A1522298B	Amplex Red	Liquid	0.5 mL	1.0 mL	-20℃.dark.
A1522298C	H₂O₂ （3%）	Liquid	0.4 mL	0.8 mL	-20℃.dark.
A1522298D	Assay Buffer (20×)	Liquid	5 mL	10 mL	-20℃.

Usage Method

1. Stock Solution Preparation

1) Thaw 20× Reaction Buffer, 10 mM Amplex Red Stock, and 50 U/mL HRP on ice; equilibrate to room temperature before use.

2) Dilute 20× Reaction Buffer with deionized water at 1:19 to prepare 1× Reaction Buffer for use.

3) 10 mM Amplex Red is a ready-to-use liquid stock. It may also be diluted to 1 mM for easier volume calculation.

4) 50 U/mL HRP is a ready-to-use liquid stock. Divide unused enzyme into single‑use aliquots and store at -20°C.

5) 20 mM Hydrogen Peroxide (H₂O₂) Working Solution

Dilute the ~3% H₂O₂ stock with 1× Reaction Buffer to the desired concentration; actual concentration is labeled on the vial.

Example: Add 22 μL of 3% (0.91 M) H₂O₂ to 978 μL of 1× Buffer to obtain 20 mM working solution.

Note: The stabilized 3% H₂O₂ stock degrades slowly, but the 20 mM working solution is unstable and must be used within a few hours of preparation.

2. Standard Preparation (0 - 2.0 mU/mL)

1) Prepare standards in the range 0-2.0 mU/mL using a 100 mU/mL intermediate stock.

2) Dilute 50 U/mL HRP with 1× Reaction Buffer to 100 mU/mL intermediate stock.

3) Prepare standards directly at the following concentrations (direct preparation is more accurate than serial dilution):

0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 2.0 mU/mL

Dilute all standards with 1× Reaction Buffer.

4) Use freshly prepared standards for each experiment. Match the diluent for samples and standards to minimize error..

3. Sample Preparation

Fresh samples are recommended. If not assayed immediately, store samples at -80℃ for up to 1 month; thaw on ice before use.

1) Animal Tissue

Rinse tissue with cold PBS to remove blood; blot dry. Weigh 0.1 g, add 1 mL of cold 1× Reaction Buffer, and homogenize on ice. Centrifuge at 10,000 g, 4℃ for 5 min. Collect supernatant on ice for assay.

2) Plant Tissue

Weigh ~0.1 g sample, add 1 mL of cold 1× Reaction Buffer, and homogenize. Sonicate on ice for 5 min (20% or 200 W; 3 sec on, 7 sec off; 30 cycles). Centrifuge at 10,000 g, 4℃ for 5 min. Collect supernatant on ice for assay.

3) Cells / Bacteria

Collect 5×10⁶ cells or bacteria; wash with cold PBS. Add 0.1 mL of cold 1× Reaction Buffer, then homogenize or sonicate on ice for 5 min. Centrifuge at 12,000 g, 4℃ for 5 min. Collect supernatant on ice for assay.

4) Plasma, Serum, Urine, and Other Biological Fluids

Deproteinize before use:Filter through a 10 kDa ultrafiltration tube and collect filtrate; or

Mix sample : 30% ZnSO₄ solution = 20:1, vortex, centrifuge at 10,000 g, room temperature for 5 min, collect supernatant.

4. Detection Working Solution Preparation

Prepare fresh before use; store on ice and protect from light.

Prepare working solution containing 160 μM Amplex Red + 0.4 mM H₂O₂:

1) 1 mM Amplex Red Stock: 160 μL

2) 20 mM H₂O₂ Working Solution: 20 μL

3) 1× Reaction Buffer: 820 μL

4) Total volume: 1 mL (enough for ~20 assays); final concentrations are halved in the reaction.

5. Peroxidase Activity Assay

1) Set up reactions as follows:

Reagent	Standard Wells	Sample Wells
Standard	50 μL	/
Sample	/	50 μL
Detection Working Solution	50 μL	50 μL

2) Mix thoroughly and incubate at 25℃ for 20-30 min in the dark.

Absorbance mode: read at 560 nm
Fluorescence mode: excitation 560 nm, emission 590 nm

6. Data Analysis

1) Subtract blank (no HRP control) values for standard curve construction.

2) ΔA _Standard = A_Standard− A _Blank 3)

ΔA _Sample = A _Sample − A _Blank

4) Plot a standard curve with standard concentration on the x‑axis and ΔA on the y‑axis. Calculate peroxidase activity in samples from the curve.

Precautions

1. Amplex® Red is light‑sensitive and easily oxidized; protect from light throughout and use promptly after opening/preparation.

2. Excessively high peroxidase concentration reduces signal; dilute samples before assay if needed.

3. H₂O₂ working solution is unstable; must be prepared fresh.

4. Avoid reductants such as DTT or 2‑mercaptoethanol in the reaction, which interfere with detection.

5. Fresh standards and a new standard curve must be used in every experiment.

规格

别名

过氧化物酶检测试剂盒 | Amplite® 荧光法过氧化物酶（HRP）检测试剂盒（近红外荧光） | 过氧化物酶（POD）荧光法测试盒 | Amplex™ Red过氧化物酶检测试剂盒

英文别名

Peroxidase Assay Kit

规格或纯度

BioReagent,比色法,适用于分析

英文名称

Peroxidase Assay Kit (Fluorometric, Colorimetric Method)

应用

细胞代谢, 过氧化物酶

检测范围

吸光法0-0.8mU/mL，荧光法0-0.4mU/mL

检测方法

吸光度法/荧光法

定量&半定量

定量

检测仪器

酶标仪

检测波长

吸光法波长A560；荧光法激发波长560，发射波长590

敏感性

Light-sensitive

检测时长

10 min

样本体积

50 μL

储存与运输

储存条件

-20°C储存

运输条件

超低温运输

稳定性与储存

各组分在相应的储存条件下保质期1年。

图片

Cell Metabolism assay: Peroxidase Assay Kit (Fluorometric Absorbance Microassay) (A1522298) - Fluorometric assay

Peroxidase Assay Kit (Fluorometric/Absorbance/Microassay)(A1522298) - Fluorometric assay

Peroxidase in the sample catalyzes the reaction of hydrogen peroxide (H₂O₂). Under horseradish peroxidase (HRP), Amplex Red reacts quantitatively with H₂O₂ at a 1:1 molar ratio to generate resorufin. Peroxidase activity is sensitively quantified by measuring resorufin fluorescence (excitation at 560 nm, emission at 590 nm) or absorbance at 560 nm (A560), with signal intensity proportional to peroxidase concentration. When the sample volume is 50 µL, the colorimetric assay method exhibits a good linear relationship in the concentration range of 0.05-0.4 mU/mL..

Cell Metabolism assay: Peroxidase Assay Kit (Fluorometric Absorbance Microassay) (A1522298) - Colorimetric assay

Peroxidase Assay Kit (Fluorometric/Absorbance/Microassay)(A1522298) - Colorimetric assay

When the sample volume is 50 µL, the colorimetric assay method exhibits a good linear relationship in the concentration range of 0.05-0.8 mU/mL..

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ZJ26F0636433	分析证书	A1522298
ZJ26F0636432	分析证书	A1522298

技术文档和文章

a1522298_过氧化酶检测试剂盒中文说明书.pdf

a1522298_peroxidase pod assay kit.pdf

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