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动物细胞核分离试剂盒
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为什么选择此级别
BioReagent,哺乳动物样品抽提用 级 ，适用于对基线干扰要求严格的色谱和分析工作流程。
储存与运输
-20°C储存。超低温运输 。请查阅批次 COA 获取详细规格。
质量文档
SDS、COA、产品数据表及规格说明书均可下载。可通过批号查询获取批次 COA。
文献证明
在色谱分析、有机合成和交叉偶联反应领域已被 0 篇同行评审文献引用。
概述
本产品是通过蔗糖密度梯度离心的方法，去除细胞质成分，从动物细胞及组织中分离获得细胞核。分离获得的细胞核即可用于试管内的凋亡分析，功能研究，如细胞转录状态的评估，也可以成为分离细胞核成分的原材料，如可分离染色质、基因组DNA、组蛋白、核RNA/RNP，或者冻存在细胞核储存液中，在后期的研究中使用。
| A777613 | Component | 1 Kit | Storage |
| A777613A | 2×细胞裂解液 | 90 mL | -20℃ |
| A777613B | 10% Triton X-100 溶液 | 1.7 mL | -20℃ |
| A777613C | 蔗糖 | 68.5 g×5 | -20℃ |
| A777613D | 5×蔗糖缓冲液 | 65 mL×2 | -20℃ |
| A777613E | 细胞核储存液 | 90 mL | -20℃ |
| A777613F | 1M DTT | 0.2 mL | -20℃ |
使用说明：
1、试剂准备
1.1 2M 蔗糖溶液制备：将20mL 5×蔗糖缓冲液加入试剂盒内提供的1瓶蔗糖 (盒内编号A777613C) 中，再补加入约15mL蒸馏水，待蔗糖完全溶解后，用蒸馏水定容至100mL，即获得 2M蔗糖溶液。
1.2 1×细胞裂解液：根据试剂使用量，用蒸馏水将2×细胞裂解液稀释2倍，得到1×细胞裂解液。
1.3 5×蔗糖缓冲液：根据试剂使用量，用蒸馏水将5×蔗糖缓冲液稀释5倍，得到1×蔗糖缓冲液。
注：所有的操作均在2~8°C下进行。
2、收获及裂解细胞
收获细胞之前，在冰上制备新鲜裂解液。对于每个样本 (1~3×10⁷细胞或1g组织)：在11mL 1×细胞裂解液中加入11μL 1M DTT，110μL 10% TritonX-100，混合后，置于冰上直至使用。
2.1 对于悬浮细胞
2.1.1 将细胞在75cm ² 培养瓶，15mL培养基中，培养至1~3×10⁷细胞。
2.1.2 将细胞转移至15mL离心管中，在4°C下，500g离心5min，小心吸出上清，将细胞沉淀置于冰上。
2.1.3 短暂涡旋沉淀，加入1mL预冷的PBS，以中等速度涡旋，使细胞全部重悬。再加入9mL PBS，混合后，将其置于冰上。500g离心5min，小心吸出上清，将细胞沉淀置于冰上。
2.1.4 短暂涡旋后，加入1mL 冰上预冷的含有DTT及TritonX-10的裂解液，以中等速度涡旋， 使其重悬；再加入9mL裂解液，混合后，冰上孵育5min。通过蔗糖密度梯度离心纯化细胞核。
2.2 对于贴壁细胞
将贴壁细胞培养于100mm或150mm培养皿中，推荐使用培养瓶。快速收获及裂解液细胞。
2.2.1 在100mm直径培养皿中，将细胞培养至0.5~3×10⁷细胞。
2.2.2 对于每个培养皿，吸去培养基，将细胞培养皿置于冰上。用10mL预冷的DPBS洗涤细胞。小心吸去培养基。
2.2.3 在培养皿中加入10mL预冷的含有DTT及TritonX-100的裂解液，用细胞刮刀收获细胞。 将其转移至15mL离心管中，短暂涡旋，在冰上孵育5min。通过蔗糖密度梯度离心纯化细胞核。
2.3 对于组织
2.3.1 从处死的动物中分离1g新鲜组织。用预冷的PBS短暂漂洗组织，吸水纸擦干。将组织置于平皿中，置于冰上。
2.3.2 用锋利的剪刀将其剪碎。
2.3.3 将剪碎的组织置于合适的容器中，加入10mL预冷的含有DTT及TritonX-100的裂解液， 在2~8°C 下均浆，完全裂解细胞并释放细胞核。可在显微镜下观察细胞裂解及细胞核的形态， 确保正确均浆。将切碎的组织转移至50mL塑料离心管中，置于冰上，高速 (20000rpm) 均浆30~45s，通过蔗糖密度梯度离心纯化细胞核。
3、通过蔗糖缓冲液离心，分离细胞核
3.1 制备1.8M 蔗糖溶液：在27mL 2M蔗糖溶液中，加入3mL蔗糖缓冲液，30μL1MDTT，新鲜制备后，置于冰上直至使用。
注：虽然不同细胞及组织的细胞核有不同的密度，在纯化的过程中，需要不同浓度的蔗糖溶液，但对于大多数的细胞及组织，推荐使用1.8M蔗糖溶液的常规流程。不同浓度的蔗糖溶液的配制如表1。
表1：不同浓度蔗糖缓冲液的配制（30mL/样本）
| 蔗糖溶液浓度 | 2M 蔗糖溶液体积 (mL) | 蔗糖缓冲液体积 (mL) |
| 2.00 M | 30 | 0 |
| 1.95 M | 29.25 | 0.75 |
| 1.90 M | 28.5 | 1.5 |
| 1.85 M | 27.75 | 2.25 |
| 1.80 M | 27 | 3 |
| 1.75 M | 26.25 | 3.75 |
| 1.70 M | 25.5 | 4.5 |
3.2 在置于冰上的10mL裂解液中加入18mL预冷的1.8M蔗糖缓冲液。轻轻混合后置于冰上。
3.3 对于每个样本，将10mL预冷的1.8M蔗糖缓冲液加入40mL超速离心管底部，置于冰上。
3.4 小心的将第1步制备的28mL裂解液加入第2步制备的蔗糖溶液上方。避免扰动蔗糖溶液层。配平试管，立即离心。
3.5 小心的将离心管置于已预冷的离心机上，在4°C下，30000g离心45min。
3.6 取出试管后，置于冰上。在每个试管的底部可见非常小的细胞核沉淀。小心的将上清液 （细胞质及细胞碎片）全部吸去，不要扰动细胞核沉淀。
注：含有细胞质成分的上清液可用于其他研究。
3.7 加入1mL预冷的细胞核储存液，短暂涡旋，使细胞核沉淀全部重悬；再加入4mL细胞核储存液，短暂涡旋后置于冰上保存。
3.8 在4°C下，500g 离心5min，收集细胞核。小心吸去上清液，将含有沉淀的离心管置于冰上。
3.9 加入200μL预冷的细胞核储存液，完全重悬细胞沉淀，置于冰上。用加样头上下吹打5~10次，打碎细胞团块。小心的将上清液转移至微量离心管中保存。
注：如果需要，可将样本计数后稀释（如下所述）。细胞核可立即使用，或保存于-70°C。在-70°C下可保存3个月。
4、细胞核产量
细胞核的数量可由台盼蓝染液染色后，用计数板计数。
注意事项：
1、推荐使用细胞核储存液或30%甘油溶液稀释细胞核溶液，防止细胞核肿胀。
2、正常的细胞核经台盼蓝染色可见同一的圆形或圆柱状蓝色表面，而细胞质污染及细胞碎片，将染为亮蓝色，有不规则的形态。
3、通过比对最终的细胞核数量与开始的细胞数量能够确认细胞核的得率。对于悬浮细胞， 样本可直接用台盼蓝染液稀释后计数。对于贴壁细胞，应用胰酶消化后，用台盼蓝染液稀释 后计数。对于组织，可评估每克组织中细胞核的产量。可参考表2及表3。
表2 从细胞中分离的细胞核产量
| 细胞 | 细胞类型 | 细胞平均值×10 ⁻⁷ | 核平均值×10 ⁻⁷ | 产量% |
| Jurkat | 人类白血病T细胞，组织培养细胞系 (悬浮细胞) | 4.3 (± 2.2) | 2.0 (± 1.6) | 48 (± 36) |
| HFN7.1 | Hybridoma，组织培养细胞系 (悬浮细胞) | 4.5 (± 3.4) | 2.4 (± 2.1) | 49 (± 16) |
| COS7 | 非洲绿猴肾细胞，组织培养细胞系(贴壁细胞) | 1.8 (± 0.4) | 0.8 (± 0.4) | 50 (± 29) |
| HEK293 | 人类胚胎肾细胞，组织培养细胞系(贴壁细胞) | 3.2 (± 0.4) | 1.5 (± 0.4) | 48 (± 12) |
| MDCK | Madin-Darby 犬细胞，组织培养细胞系(贴壁细胞) | 2.9 (± 1.1) | 0.5 (± 0.2) | 19 (± 10) |
a. 表中的数据为三次独立实验的平均结果，括号中为标准差。
b. 贴壁细胞的数据为100mm培养皿制备的细胞。胰酶消化后进行细胞计数。悬浮细胞为75cm ² 培养瓶中15mL培养基的细胞。
表3：从动物组织中分离细胞核的产量
| 组织 | 均浆细胞核/g平均值×10 ⁻⁷ | 纯化细胞核/g平均值×10 ⁻⁷ | 产量 |
| 小鼠肝组织 | 15.2 (± 5.2) | 6.2 (± 1.7) | 43.1 (± 14.1) |
| 小鼠肾组织 | 31.8 (± 5.3) | 18.4 (± 6.4) | 59.5 (± 23.2) |
a. 表中的数据为三次独立实验的平均结果，括号中为标准差。
b. 每次使用0.8~1.6g 新鲜分离的组织。
4、需自备超速离心机，30000g。
5、需自备蛋白酶抑制剂、PBS、台盼蓝染液。
6、所有步骤均在2~8°C进行，所用溶液及设备均需2~8°C预冷。
7、如果细胞核产量较低，可能是由于细胞核密度不同导致，可尝试使用不同浓度的蔗糖缓冲液。
规格
规格或纯度
BioReagent, 哺乳动物样品抽提用, 10-20T
英文名称
Animal Cell Nuclear Separation Kit
储存条件
-20°C储存
运输条件
超低温运输
产品线
生物产品
名称和识别符
分子类型
试剂盒
技术文档
高级数据
质检证书（CoA,COO,BSE/TSE 和分析图谱)
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| 批号(Lot Number) | 证书类型 | 货号 |
|---|---|---|
 ZJ25F0724229 |
分析证书 | A777613 |
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