本公司生产的环状 RNA 合成试剂盒，即 Circular RNA Synthesis Kit 也称 Circular RNA Preparation Kit 即环状 RNA 制备试剂盒或环形 RNA 制备试剂盒，是一种非常便捷和高效的通过酶学方法将单链 RNA (ssRNA)转化成环状 RNA (circRNA)的试剂盒。合成的 circRNA 可以用于转染细胞研究circRNA 的生物学功能等。近期有研究表明环状 RNA 也可以用作 mRNA 疫苗 (mRNA vaccine)。环状 RNA 是一种通过典型的 5'-3'磷酸二酯键形成的环状结构的 RNA 分子，这种结构特征使得其不受 RNA 外切酶的影响，表达更稳定，不易降解。circRNA 是生物体内源存在的一种通常为单链的环状RNA，可以在内含子反向剪接(trans-splicing)等过程中产生。环状 RNA 的研究可以采用质粒或病毒表达的方式，通过反向剪接等产生 circRNA。但通过质粒或病毒等产生 circRNA 的过程中涉及反向剪接等辅助性的过程，有可能会干扰研究结果。如果能直接转染合成的 circRNA，就能更直接地研究 circRNA 的生物学功能。本试剂盒进行单链 RNA 的环化反应的原理是，通过 RNA 环化酶(RNA Cyclase)环化 5'磷酸化 3'羟基的单链 RNA。本试剂盒环化效率高，操作便捷。环化效率通常可以达到 95%以上，且操作仅需一步孵育即可完成。通常本试剂盒能将 95%以上的 5'磷酸化 3'羟基的单链 RNA (ssRNA)转化成环状 RNA (circRNA)，因此环化产物可以不需要切胶纯化，仅需热失活环化酶后通过乙醇沉淀即可用于后续实验。
组分和说明
| C1373102-CG20T | Component | 20T | 5*20T | Storage | | C1373102A | RNA Cyclase | 20μl | 5*20μl | -20℃. Avoid freeze/thaw cycle. | | C1373102B | 10X RNA Cyclase Buffer | 50μl | 5*50μl | -20℃. Avoid freeze/thaw cycle. | | C1373102C | 20X Cyclase Enhancer I | 30μl | 5*30μl | -20℃. Avoid freeze/thaw cycle. | | C1373102D | 5X Cyclase Enhancer II | 100μl | 5*100μl | -20℃. Avoid freeze/thaw cycle. | | C1373102E | DEPC-treated Water | 400μl | 5*400μl | -20℃. Avoid freeze/thaw cycle. |
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产品应用
是一种非常便捷和高效的通过酶学方法将单链 RNA (ssRNA)转化成环状 RNA (circRNA)的试剂盒，合成的 circRNA 可以用于转染细胞研究 circRNA的生物学功能等。
产品优势
本试剂盒环化效率高，操作便捷。
使用说明：
1.参考下表在冰浴中配制如下反应体系：
| Reagent | Volume | Final Concentration | | DEPC-treated Water | 15.5µl | / | | ssRNA (20µM) | 0.5µl | 0.5µM | | 10X RNA Cyclase Buffer | 2µl | 1X | | 20X Cyclase Enhancer I | 1µl | 1X | | RNA Cyclase | 1µl | / | | Total Volume | 20µl | / |
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注意：
a. 由于涉及 RNA 操作，需要严格按照 RNA 操作的规范进行，避免 RNase 污染，相关试剂和耗材需要经过 DECP 处理去除 RNase 或者确保是RNase free 的。由于涉及单链 RNA，可以考虑适量添加 RNase Inhibitor。
b. 上述表格中 ssRNA 的用量已经比较大，对于样品比较少的情况下，完全可以大幅减少 ssRNA 的用量的。
c. 如果同时进行多个连接反应，可以把上表中除 ssRNA 之外的所有溶液和酶提前预混合，然后再分装到各反应管内。
d. 如果发现环化效果欠佳，可以考虑酌情添加 5X Cyclase Enhancer II，20µl 反应体系中需要添加 4µl 5X Cyclase Enhancer II。添加5X Cyclase Enhancer II 可以增强环化效率，但同样也会增强非特异性的连接反应。
2. 环化反应：37℃孵育 30min。如果发现效果欠佳可以尝试 25℃孵育 2h 或 16℃孵育 16h。为了使连接反应更加充分，可以适当延长连接反应时间。
3. 终止反应：65℃孵育 15min，即可终止反应。
4. 环化产物的电泳鉴定：电泳上样前 95℃孵育 5min 随后置于冰浴，以充分变性。尿素(7M)变性聚丙烯酰胺凝胶(15%)进行凝胶电泳分析。环状 RNA 的电泳迁移率会变快一点。
5. 浓缩与纯化：可以采用常规的乙醇沉淀方法进行浓缩并去除环化反应体系中的缓冲液成分。
保存条件：
-20℃ 保存，至少一年有效。
注意事项：
（1）底物单链 RNA 的 3'端必须是羟基，5'端可以是磷酸化，也可以是腺苷酰化。
（2）本试剂盒提供的环化反应体系可以按照比例放大反应体系，对环状 RNA 产物的得率无显著影响。
（3）本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
（4）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
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