本公司生产的等温扩增变色检测试剂盒是一种通过环介导等温扩增(Loop Mediated Isothermal Amplification, LAMP)法扩增 DNA 并通过反应体系的颜色变化检测样品中是否有目的 DNA 的试剂盒。本试剂盒采用了 dU 掺入和 UDG 酶防止等温扩增产物污染技术，可快速、有效、高灵敏度地检测样品中的目的 DNA，并且采用可视化变色技术，无需电泳，通过肉眼观察颜色变化即可判断结果。本试剂盒通过自行设计等温扩增引物，可以用于检测样品中是否存在病原体、微生物等，例如生物样品中是否存在特定病原体的感染或微生物的污染等。等温扩增技术(Isothermal amplification technology)是核酸体外扩增技术，其反应过程始终维持在一定的恒定温度下，通过添加不同活性的酶和各自特异性引物进行核酸的快速扩增。本试剂盒采用的是环介导核酸等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)，其特点是针对靶基因的不同区域设计4-6 条特异引物，使用链置换 DNA 聚合酶(Bst DNA Polymerase)启动 DNA 的合成，形成哑铃状互补链，并进一步通过连续链置换进入循环扩增阶段，扩增的最后产物是具有不同个茎环结构、多环花椰菜样结构的 DNA 的混合物。LAMP 仅需在等温条件下(如 60-65ºC)保温 30-60 分钟，即可完成核酸扩增反应。与常规 PCR 相比，LAMP 不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，具有简单、快速、灵敏性高、特异性强等特点。本试剂盒灵敏度高，反应时间短。本试剂盒的灵敏性比传统的 PCR 方法高 2-5 个数量级，通过阳性质粒计算检测下限约为 20-200 copies/μl。且仅需 1 个小时就能完成检测反应。本试剂盒采用可视化变色技术，无需电泳，通过肉眼观察颜色变化即可判断结果。本试剂盒优化了指示剂染料，样品中的目的 DNA 片段被快速大量扩增后，反应管内液体的颜色由紫罗兰或蓝紫色变成天蓝色或深天蓝色即为目的 DNA 阳性。
组分和说明
| C1373200-CG25T | Component | 25T | 4×25T | Storage | | C1373200A | LAMP Master Mix with UDG (2X) | 250μl | 4×250μl | -20℃. Avoid freeze/thaw cycle. | | C1373200B | Bst DNA Polymerase | 25μl | 4×25μl | -20℃. Avoid freeze/thaw cycle. | | C1373200C | Positive Control | 50μl | 4×50μl | -20℃. Avoid freeze/thaw cycle. | | C1373200D | Nuclease-free Water | 200μl | 4×200μl | -20℃. Avoid freeze/thaw cycle. | | C1373200E | Mineral Oil | 500μl | 4×500μl | -20℃. Avoid freeze/thaw cycle. |
|
产品应用
本试剂盒采用可视化变色技术，无需电泳，通过肉眼观察颜色变化即可判断结果。本试剂盒含 Bst 酶、UDG 酶、PCR Buffer、dNTP、dUTP、可视化染料，只需加入适量特异引物、待测样品和水即可检测目的 DNA。
产品优势
本试剂盒灵敏度高，反应时间短。本试剂盒采用防污染技术，有效避免污染。
使用说明
1. 需要用户自备的耗材、仪器和试剂：
a. 水浴锅或者普通 PCR 仪。
b. DNase-free 的带滤芯吸头，0.2ml PCR 管。
2. 样本和引物准备：
a. 准备含 DNA 的样品。如果是含 DNA 的样品，例如血清、细胞培养液、微量的细胞、病毒、细菌或真菌，很多情况下可以直接检测；也可以是其它纯化后的 DNA 样品。
注 1：样品加入量一般为反应体系 1/10 的量或更少。
注 2：如果样品不能及时检测，可以置于-20ºC或者-80ºC 保存，可放置 1-2 个月。
注 3：含 DNA 的生物样品如果直接检测效果欠佳，可以尝试纯化 DNA 样品后再进行检测。
b. 准备特异的 LAMP Primer Mix (10X): 16 µM FIP/BIP，2 µM F3/B3，4 µM Loop F/B each(可选)。可以根据目的片段，自行设计或使用专门的 LAMP 引物设计软件 PrimerExplorer 等设计引物。
3. LAMP 反应体系的设置：
a. 融解并混匀反应所需的各种溶液，置于冰浴上或冰盒内。
b. 参考下表在室温或冰浴上设置 LAMP 反应体系(以每孔反应体系为 20µl 为例)。下表中的 Template 为样品、阴性对照(Negative Control)或阳性对照(Positive Control)。Negative Control 可使用溶解 DNA 样品的溶液或 Nuclease-free Water，Positive Control 可使用阳性质粒等。如果使用试剂盒中的 Positive Control，由于其中已经包含了特异引物，不需要再添加 LAMP Primer Mix (10X)，需要再添加 2μl 的 Nuclease-free Water。建议每次检测都设置 Negative Control 和 Positive Control。
| Reagent | Volume for Sample | Volume for Positive Control | | LAMP Master Mix with UDG (2X) | 10μl | 10μl | | Nuclease-free Water | 5μl | 7μl | | LAMP Primer Mix (10X) | 2μl | / | | Template | 2μl | 2μl | | Bst DNA Polymerase | 1μl | 1μl | | Total Volume | 20μl | 20μl |
|
c. 用移液器轻轻吹打混匀或轻微 Vortex 混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底。
d. 如果使用含热盖的 PCR 仪，可直接开始反应；如果使用水浴锅反应，每管需要添加 20μl Mineral Oil 以防止水份蒸发至管盖，影响反应效果。
4. 反应条件：
a. 37ºC 水浴或 PCR 仪反应 5-10 分钟，通常就可以有效去除反应体系内可能的本试剂盒等温扩增产物造成的环境污染。说明：初次进行检测时无需进行本步骤；确定从未打开等温扩增反应体系管盖的情况下，也无需进行本步骤；仅当本试剂盒的的扩增产物可能污染检测环境的时候，需要执行本步骤。
b. 后续如果使用水浴锅反应，应提前使温度上升至 61ºC，然后放入带浮漂的反应管，水浴 60 分钟。水浴锅的温度波动需要尽量控制在1ºC 以内。
c. 后续如果使用 PCR 仪反应，按照“61ºC，60 分钟；4ºC，forever；热盖温度，105ºC”设定程序。注：引物不同，对应的最适等温扩增温度也略有差异，须进行一定的优化，通常在 60-65ºC 之间。
5. 结果判断：
取出反应管，室温放置，以白色为背景，观察颜色变化。如果显示紫罗兰或蓝紫色，为阴性；如果显示天蓝色或深天蓝色，则为阳性。
注 1：如果样品中模板量比较多，在 30-60 分钟时即可出现颜色变化；如果样品中模板量比较少，需将反应适当延长至总计 65-70 分钟。如果延长时间后，仍然没有变色，即为阴性。延长时间过久，阴性也可能会变色，出现假阳性。
注 2：反应后，切勿开盖。等温扩增的产物非常多，气溶胶等因素很容易污染实验环境。判断结果后，密封后按实验室废弃物处置要求进行处理。如果确需开盖进行后续的分析检测，建议在相对隔离的其它实验室内操作。
保存条件：
-20℃保存，≤0℃运输
注意事项：
（1）使用前需确保试剂完全融化，上下颠倒轻轻混匀后使用。混匀过程中尽量避免产生气泡。经测试，本产品反复冻融 10 次对使用效果无显著影响，但仍需尽量避免反复冻融。反复冻融可能使产品性能下降。
（2）等温扩增是超高灵敏度的检测，请尽量在标准的 PCR 实验室中进行检测。等温扩增反应设置区域须尽量避免各种可能的扩增产物的污染。尽管本试剂盒采用 UDG 酶防污染技术，但请仍勿打开 PCR 管盖，等温扩增产物宜密封后按扩增后产物要求处理，以避免超高浓度的扩增产物由于气溶胶等因素污染实验环境。
（3）本产品含颜色指示剂，未进行反应前，如果加入样品后颜色和阴性、阳性颜色有明显差异，则需要稀释样品或者使用 DNA 提取试剂盒处理样品，或者需要适当调整样品的 pH 至接近中性。
（4）本等温扩增体系需要高浓度的二价离子，样品中不能含有高浓度的 EDTA 等金属离子螯合剂。
是否无菌：否
危险品化学品经营许可证（带存储）