是否无菌:是
外泌体是由细胞分泌的包含 RNA 和蛋白质的小囊泡(30-150 nm),在血液、唾液、尿液及乳汁等体液中大量存在。外泌体被认为具有细胞间信使的功能,在特定细胞之间传递它们的效应物或信号分子;然而其构造、效应物组成以及所参与的生物学通路目前尚不明晰。
外泌体的生物学功能研究中需要分离完整的外泌体颗粒,而传统超速离心方法步骤繁琐、硬件要求高、操作难度大。该外泌体快速提取试剂,组分经过优化处理,适用于细胞培养上清液中的外泌体提取,可快速高效地获得外泌体颗粒,可用于电镜分析、NTA 粒径分析、核酸分析、蛋白分析、细胞学实验和动物实验等。
自备材料:
高速离心机,涡旋振荡器,50 mL 离心管,1.5 mL 离心管,1×PBS 缓冲液(无菌)。
操作规程:
一、 样品预处理
1、 取样:如果是冻存样品,从冰箱取出后于 25℃水浴中进行解冻,将完全融化后的样品置于冰上,如果是新鲜样品,收集样品后置于冰上;
2、 样品初始用量:单次提取时的样品量建议细胞培养上清液不低于 20 mL;
3、 离心去细胞碎片:将样品转移至离心管中,于 4℃以3,000 ×g(~5,200 rpm**)离心 10 min,去除样品中的细胞碎片(注:若沉淀较多,可 3,000 ×g,10 min离心多次至无明显沉淀,每次取离心上清液);
**为约10 cm有效离心半径的大离心机换算(≥15 mL离心管),下同。
4、 离心去杂质碎片:将离心上清液转移至新的离心管中,于 4℃以 10,000 ×g(~9,500 rpm**)离心 10 min,去除样品中的杂质碎片;
5、 上清液转移:去除杂质碎片的上清液转移到新离心管中。
二、 提取外泌体
1、 上清液预处理:在去除杂质的离心上清液中加入外泌体提取试剂 (细胞上清),具体的加入剂量为20 mL样品量加入5 mL 外泌体提取试剂 (细胞上清);其他剂量请根据该用量等比例换算。
2、 溶液混合:加入外泌体提取试剂 (细胞上清) 后将离心管盖紧,通过涡旋振荡器混匀 1 min,再放置于 4℃静置8 h 以上;
注:增加静置时间可提高外泌体得率,但不可超过 24 h。
3、 沉淀外泌体:取出装有混合液的离心管于 4℃以 10,000 ×g(~9,500 rpm**)离心 60 min,弃上清,沉淀中富含外泌体颗粒(注:尽可能吸尽上清液);
4、 再次离心:将含有沉淀的离心管再次于 4℃以 10,000 ×g(~9,500 rpm**)离心 2 min,弃上清(注:尽可能吸尽上清液);
5、 外泌体重悬:取合适量的 1×PBS 均匀吹打离心沉淀物,待其溶解后,将重悬液转移至新的 1.5 mL 离心管中(建议每 20 mL 细胞培养上清用 200 μL 左右 1×PBS 重悬);
6、 收获外泌体颗粒:将含有重悬液的1.5 mL 离心管于4℃以 12,000 ×g(~12,400 rpm*)离心 2 min,保留上清液,其中富含外泌体颗粒(注:若沉淀较多,可 12,000×g,2min 离心多次至无明显沉淀,每次取上清液)。
*为约 7 cm 有效离心半径的小离心机换算(≤2 mL 离心管)。
7、 外泌体的保存:纯化后的外泌体以合适体积进行分装冻存于-80℃低温冰箱中,以备后续实验使用。
注意:
本产品仅用于生命科学研究,不得用于医学诊断及其他用途。
Is it sterile: Yes