计算溶液所需的质量、体积或浓度。
石蜡包埋组织总RNA提取试剂盒 (DNase I)
有货
为什么选择此级别
BioReagent,分子生物学级 ，适用于对基线干扰要求严格的色谱和分析工作流程。
储存与运输
2-8°C储存,室温。低温运输 。请查阅批次 COA 获取详细规格。
质量文档
SDS、COA、产品数据表及规格说明书均可下载。可通过批号查询获取批次 COA。
文献证明
在色谱分析、有机合成和交叉偶联反应领域已被 0 篇同行评审文献引用。
概述
本试剂盒采用环保脱蜡的方式去除石蜡，通过优化的缓冲液体系可以高效释放组织切片中的RNA，同时克服了福尔马林交联所导致的抑制因素，提取的RNA可直接用于Northern杂交、斑点杂交、mRNA纯化、体外翻译、RNA分解酶的保护分析、RT-PCR、Real Time RT-PCR和构建cDNA文库等各种分子生物学实验。
注意事项
1. 操作人员应戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套，并使用无RNase的塑料制品及枪头，避免RNase污染。
2. DNase I 储存液的配制：用1 mL注射器将550 μL RNase-Free ddH₂O注入装有DNase I 干粉的瓶中，轻柔混匀至溶解，分装后-30~-15℃储存（可保存9个月），每次根据用量需求取出。配制的DNase I 工作液置于2-8℃储存（可保存42天），避免反复冻融。
操作步骤
使用前准备：在12 mL Buffer RW2 中加入48 mL的无水乙醇。
1. 样本处理
1.1 石蜡切片：取石蜡切片 5–8 张（5–10 μm 厚，1×1 cm² 大小）置于 1.5 mL 离心管中。
1.2 石蜡包埋样本：用手术刀刮取约 10 mg 的组织样本（尽量去除多余的石蜡），置于 1.5 mL 离心管中。
注意：如果样品表面暴露于空气中，请将接触空气的 2–3 片弃掉不用。
2. 加入 600 μL 环保脱蜡液，涡旋混匀，56 ℃ 孵育 5 min，剧烈涡旋 15–30 sec 让石蜡充分溶解。
3. 14,000 rpm（18,630 × g）离心 2 min，吸弃上清（避免吸弃沉淀），瞬离后离心管底部剩余脱蜡液可用 200 μL 枪头吸净。（若脱蜡不彻底，重复该步骤一次。）
4. 加入 200 μL Buffer RF 和 20 μL Proteinase K，涡旋 5–10 sec 后瞬时离心。
5. 56 ℃ 消化 30–60 min（至样品消化完全后），80 ℃ 孵育 20 min。
6. 14,000 rpm（18,630 × g）离心 1 min，转移 200 μL 上清液至新的 1.5 mL 离心管中。
7. 加入 200 μL Buffer RFB 和 200 μL Buffer RB 至消化液中，涡旋混匀 15 sec，将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱 RPT（吸附柱放在收集管中），12,000 rpm（13,680 × g）离心 30 sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
8. 向吸附柱中加入 350 μL Buffer RW，12,000 rpm（13,680 × g）离心 30 sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
9. DNase I 工作液的配制：取 10 μL DNase I 储存液放入新的 RNase-Free 离心管中，加入 70 μL DNase I Buffer，轻柔混匀。
10. 向吸附柱中央加入 80 μL 的 DNase I 工作液，室温放置 15 min。
11. 向吸附柱中加入 350 μL Buffer RW，12,000 rpm（13,680 × g）离心 30 sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
12. 向吸附柱中加入 500 μL Buffer RW2（使用前请先加入无水乙醇），12,000 rpm（13,680 × g）离心 30 sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
13. 重复步骤 12。
14. 12,000 rpm（13,680 × g）离心 2 min。
15. 将吸附柱转移至一个新的 1.5 mL RNase-Free 离心管中，打开吸附柱管盖，室温放置 1 min，以彻底晾干吸附柱中的无水乙醇。向吸附膜中间部位悬空滴加 30–100 μL RNase-Free ddH₂O，室温放置 1 min，12,000 rpm（13,400 × g）离心 1 min。得到的 RNA 可直接用于下游实验，或于 -80 ℃ 以下保存。
RNA 完整性、浓度及纯度检测
完整性：
RNA 可用普通琼脂糖凝胶电泳（电泳条件：胶浓度 1–1.2 %；0.5 × TBE 电泳缓冲液；120–150 V，15–25 min）检测完整性。由于 rRNA 占 RNA 总量的 80 % 以上，电泳后 UV 下应能看到非常明显的 rRNA 条带。不同物种 rRNA 类型及大小会有差异：
动物：28S（4.7–5.0 kb）、18S（1.9 kb）、5S（120 bp）
植物：25S（3.7 kb）、18S（1.9 kb）、5S（120 bp）
大肠杆菌：23S（2.9 kb）、16S（1.5 kb）、5S（120 bp）
昆虫/软体动物：18S 通常会比 28S 条带亮。
条带模糊且弥散拖尾一般表明 RNA 严重降解，建议重新电泳或提取，否则 qPCR 可能出 Ct 值，但准确性与重复性不佳。
浓度：
通过测量分光光度计中 260 nm 处的吸光度（A₂₆₀）确定 RNA 浓度，用 RNase-Free ddH₂O 进行调零，260 nm 处 1 个单位的吸光度相当于 40 μg/mL RNA。
纯度：
A₂₆₀/A₂₈₀ 比值可以用来评估核酸纯度。A₂₆₀/A₂₈₀ 比值在 1.8–2.1 之间时，意味着高纯度的 RNA。A₂₆₀/A₂₈₀ 比值同时依赖于 pH 值及离子强度；当 pH 升高时，A₂₈₀ 读数会降低，而 A₂₆₀ 则不受影响，这会导致 A₂₆₀/A₂₈₀ 比值的升高。由于水通常都具有酸性 pH 值，它会降低 A₂₆₀/A₂₈₀ 比值。我们推荐使用弱碱性 pH 的缓冲溶液（例如 TE，pH 8.0）作为稀释液及空白对照，以确保得到精确、可重复的读数。
This kit uses an eco-friendly dewaxing method to remove paraffin. The optimized buffer system efficiently releases RNA from tissue sections while overcoming the inhibitory factors caused by formalin cross-linking. The extracted RNA can be directly used in various molecular biology experiments, including Northern blot, dot blot, mRNA purification, in vitro translation, RNase protection assay, RT-PCR, Real-Time RT-PCR, and cDNA library construction.
Precautions
Operators should wear disposable masks and gloves. Change gloves frequently and use RNase-free plasticware and pipette tips to avoid RNase contamination.
Preparation of DNase I stock solution: Use the 1 mL syringe to inject 550 μL of RNase-Free ddH₂O into the vial containing DNase I powder. Gently mix until dissolved. Aliquot and store at –30 to –15°C (stable for 9 months). Thaw only the amount needed for each use. The prepared DNase I working solution can be stored at 2–8°C (stable for 42 days). Avoid repeated freeze-thaw cycles.
Protocol
Preparation before use: Add 48 mL of absolute ethanol to the 12 mL Buffer RW2 bottle.
1. Sample Preparation
1.1 Paraffin sections: Place 5–8 sections (5–10 μm thick, 1×1 cm²) into a 1.5 mL centrifuge tube.
1.2 Paraffin-embedded tissue: Use a scalpel to scrape approximately 10 mg of tissue (remove as much excess paraffin as possible) and place into a 1.5 mL centrifuge tube.
Note: If the sample surface has been exposed to air, discard the outermost 2–3 sections.
2. Add 600 μL of Eco-friendly Dewaxing Solution, vortex to mix, incubate at 56°C for 5 min, then vortex vigorously for 15–30 sec to fully dissolve the paraffin.
3. Centrifuge at 14,000 rpm (18,630 × g) for 2 min. Aspirate and discard the supernatant (avoid removing the pellet). Briefly centrifuge again, then use a 200 μL pipette tip to remove any residual dewaxing solution from the bottom of the tube. (If dewaxing is incomplete, repeat this step once.)
4. Add 200 μL Buffer RF and 20 μL Proteinase K. Vortex for 5–10 sec, then briefly centrifuge.
5. Digest at 56°C for 30–60 min (until the sample is completely digested), then incubate at 80°C for 20 min.
6. Centrifuge at 14,000 rpm (18,630 × g) for 1 min. Transfer 200 μL of the supernatant to a new 1.5 mL centrifuge tube.
7. Add 200 μL Buffer RFB and 200 μL Buffer RB to the digestion solution. Vortex to mix for 15 sec. Transfer the entire mixture (including any precipitate) to a Spin Column RPT (placed in a collection tube). Centrifuge at 12,000 rpm (13,680 × g) for 30 sec. Discard the flow-through and place the column back into the collection tube.
8. Add 350 μL Buffer RW to the column. Centrifuge at 12,000 rpm (13,680 × g) for 30 sec. Discard the flow-through and return the column to the collection tube.
9. Preparation of DNase I working solution: In a fresh RNase-Free centrifuge tube, mix 10 μL of DNase I stock solution with 70 μL of DNase I Buffer. Gently mix.
10. Add 80 μL of DNase I working solution to the center of the column membrane. Incubate at room temperature for 15 min.
11. Add 350 μL Buffer RW to the column. Centrifuge at 12,000 rpm (13,680 × g) for 30 sec. Discard the flow-through and return the column to the collection tube.
12. Add 500 μL Buffer RW2 (ensure that absolute ethanol has been added before first use). Centrifuge at 12,000 rpm (13,680 × g) for 30 sec. Discard the flow-through and return the column to the collection tube.
13. Repeat step 12.
14. Centrifuge at 12,000 rpm (13,680 × g) for 2 min.
15. Transfer the column to a new 1.5 mL RNase-Free centrifuge tube. Open the lid and let it stand at room temperature for 1 min to completely dry the residual ethanol. Add 30–100 μL of RNase-Free ddH₂O to the center of the membrane (do not touch the membrane). Let stand at room temperature for 1 min, then centrifuge at 12,000 rpm (13,400 × g) for 1 min. The eluted RNA can be used directly for downstream applications or stored at –80°C or below.
RNA Integrity, Concentration, and Purity Assessment
Integrity:
RNA integrity can be assessed by standard agarose gel electrophoresis (conditions: 1–1.2% agarose gel; 0.5× TBE running buffer; 120–150 V, 15–25 min). Since rRNA constitutes more than 80% of total RNA, distinct rRNA bands should be visible under UV after electrophoresis. The sizes of rRNA types vary by species:
Animals: 28S (4.7–5.0 kb), 18S (1.9 kb), 5S (120 bp)
Plants: 25S (3.7 kb), 18S (1.9 kb), 5S (120 bp)
E. coli: 23S (2.9 kb), 16S (1.5 kb), 5S (120 bp)
Insects/Mollusks: The 18S band is typically brighter than the 28S band.
Faint, smeared, or diffuse bands usually indicate severe RNA degradation. It is recommended to repeat the electrophoresis or re-extract the RNA. Otherwise, qPCR may yield Ct values but with poor accuracy and reproducibility.
Concentration:
Measure the absorbance at 260 nm (A₂₆₀) using a spectrophotometer. Zero the instrument with RNase-Free ddH₂O. One unit of A₂₆₀ corresponds to 40 μg/mL of RNA.
Purity:
The A₂₆₀/A₂₈₀ ratio is used to assess nucleic acid purity. A ratio between 1.8 and 2.1 indicates highly pure RNA. The A₂₆₀/A₂₈₀ ratio is pH- and ionic strength‑dependent. At higher pH, the A₂₈₀ reading decreases while A₂₆₀ remains unchanged, resulting in a higher ratio. Since water is typically acidic, it can lower the A₂₆₀/A₂₈₀ ratio. We recommend using a slightly alkaline buffer (e.g., TE, pH 8.0) as the diluent and blank to obtain accurate and reproducible readings.
规格
规格或纯度
BioReagent,分子生物学级
英文名称
FFPE Total RNA Extraction Kit (DNase I)
应用
RNA Extraction
样品类型
石蜡包埋组织
储存与运输
储存条件
2-8°C储存,室温
运输条件
低温运输
稳定性与储存
各组分在相应的储存条件下保质期15个月。
组分与储存
| F1522773 | Component | 50T | Storage |
|---|---|---|---|
| F1522773A | 环保脱蜡液 | 33 mL | RT |
| F1522773B | Buffer RF | 12 mL | RT |
| F1522773C | Buffer RFB | 12 mL | RT |
| F1522773D | Buffer RB | 20 mL | RT |
| F1522773E | Buffer RW | 38 mL | RT |
| F1522773F | Buffer RW2 | 12 mL | RT |
| F1522773G | RNase-Free ddH₂O | 15 mL | RT |
| F1522773H | Proteinase K | 1.2 mL | RT |
| F1522773I | 吸附柱RPT (含2mL收集管) | 1 ea × 50 | RT |
| F1522773J | RNase-Free 离心管 (1.5mL) | 1 ea × 50 | RT |
| F1522773K | 1mL 注射器 | 1 ea | RT |
| F1522773L | DNase I | 1 ea | 2–8°C |
| F1522773M | DNase I Buffer | 4 mL | 2–8°C |
| F1522773N | RNase-Free ddH₂O | 1 mL | 2–8°C |
F1522773A-K：室温保存，15个月。
F1522773L-N：2-8℃保存，15个月。
若Buffer RF产生沉淀，使用前可在37℃水浴中预热5-10 min以溶解沉淀，不影响效果。
技术文档
高级数据
质检证书（CoA,COO,BSE/TSE 和分析图谱)
C of A & Other Certificates(BSE/TSE, COO):
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| 批号(Lot Number) | 证书类型 | 货号 |
|---|---|---|
 F2604355 |
分析证书 | F1522773 |
| ZJ26F0535607 |
分析证书 | F1522773 |
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