基本信息

CAS号：207291-81-4

分子量：192.1

公式：C5H3FN2O4。H2O

命名法：5-氟-4-嘧啶羧酸；5-氟-1,2,3,6-四氢-2,6-二氧-（9CI）；1,2,3,6-四氢-2,6-二氧-5-氟-4-嘧啶羧酸。

溶解度：我们建议首先在ddH2O中部分溶解FOA，然后高压灭菌以获得完全溶解性

    NH4OH/H2O（1:1）：50mg/ml

    二甲基亚砜：易溶于二甲基亚砜。高浓度的二甲基亚砜对细胞有毒。建议使用低浓度。

    H2O：微溶。在H2O中。易溶于热。耐沸腾。

    乙醇：微溶于乙醇。

    甲醇：微溶于甲醇。

外观：米白色至浅黄色粉末。

熔点：约258°C的FOA在高温（即沸腾和高压釜条件）下稳定参考关于稳定性测试数据的美国生物学参考文章

储存和稳定性：冻干粉末可在室温或4°C下储存。参见溶解度。使用过程中，保护复原产品免受光线照射，并在4°C下储存。对于长期储存，等分样品在-20°C下储存。等分样品在-20°C下稳定6个月。

5-氟甲酸（FOA）的热稳定性

        研究人员使用芽殖酵母，酿酒酵母，有大量的遗传工具可供使用。其中包括已开发用于酿酒酵母的多种类型和拷贝数的质粒。使用这些质粒的转化子的选择通常依赖于合成各种氨基酸（亮氨酸、组氨酸、色氨酸等）或核苷酸碱基（通常为腺嘌呤或尿嘧啶）所需基因中基因组突变的互补。最近使用了金电阻。

大多数实验室菌株缺乏功能性URA3基因，可以通过在质粒上提供URA3或整合到基因组中来补充尿嘧啶营养缺陷型。也可以通过在生长培养基中加入5-氟乙酸（5-FOA）来选择URA3菌株。具有野生型URA5和URA3基因的细胞将5-FOA转化为有毒物质5’氟尿嘧啶单磷酸，严重限制了细胞的生长。利用一个标记进行正选择和负选择的能力使酵母研究人员能够设计出巧妙的筛选和遗传方案。

        5-FOA的使用并不总是像理论所规定的那样简单。许多研究人员很难从使用5-FOA的实验中获得可重复的结果。其原因并不总是显而易见的。这些轶事使研究人员质疑5-FOA在光、热、溶液等条件下的稳定性。一些研究方案甚至建议煮沸以完全溶解5-FOA。

        以下实验旨在证明这些可变条件对5-FOA最终使用的影响，即尿嘧啶营养缺陷型的生长抑制。

        5-FOA取自美国生物冷冻库存和在-20°C（对照）或45°C下孵育16小时的等分试样（以模拟过热UPS卡车中无保护的地面运输）。为了研究煮沸的效果，我们还向5-FOA等分试样中加入5ml水，并在沸水中培养10分钟。然后，我们将1g/L的5-FOA添加到合成完整培养基中（26.7g/L滴出基，2g/L SC滴出氨基酸补充剂），搅拌直到观察不到颗粒物（通常10-30分钟）。通过0.2um的过滤器过滤培养基进行消毒。

        我们在5-FOA培养基上接种在SC ura（26.7g/l滴出基，2g/l滴出混合物减去尿嘧啶）中生长的W303a pRS316过夜培养物。生长后测量OD600。

        与SC对照相比，所有5-FOA样品，无论其上堆积的热滥用，都严重限制了URA3培养物的生长。事实上，煮沸的样品始终优于未煮沸的对照品。这可能是由于5-FOA的完全公开。

        我们得出结论，5-FOA在至少1-2周的短时间内非常耐热。它可以通过地面安全运输，无需温度保护。

程序

1.在本程序的任何时候使用之前，制造商必须对所有材料、试剂、玻璃器皿、尖端等进行高压灭菌或认证无菌。

2.所有相关数据和结果将记录在文件编号：200–009，QC测试请求中。包括所用所有材料的批号、属、种和受试生物的ATCC登录号、培养箱编号和培养箱中的环境条件。

3.本试验首选的真菌细胞系是白色念珠菌菌株CFD1。

4..在计划测试前两天准备SC琼脂平板和URA脱落平板。

5.用CFD1菌落接种5ml Ura滴出培养基。在30°C下培养过夜。

6.通过结合1.335g脱附基和制备SC。1g SC在50ml最终体积中滴出混合物，并过滤灭菌。通过结合1.335g脱落基制备SC-FOA，。1g SC辍学混合物，以及。50ml总体积中的050g 5'FOA，过滤消毒。通过在黑暗中称量FOA并将溶液保存在铝箔覆盖的250ml烧瓶中，避免将5’FOA暴露在光下。

7.向SC和SC-FOA烧瓶中添加1ml过夜培养物。在30°C下摇动过夜。将每种培养物稀释1:100和1:10000。

8.将每种培养物稀释1:100和1:10000。

9.将100ul原培养物和每个稀释液放在两个板上，每个板上的URA滴出液和SC滴出液。

10.在30°C下培养2天。

11.在每个含有5–500个菌落的平板上计数菌落。计算原始培养基中的密度。

12.接受5’FOA的标准：在任何给定稀释度下，SC滴出板上的菌落数量必须大于URA滴出板的1000倍。

常见问题

1.选择培养基的pH值是多少？

答：FOA选择在pH 4.5以上分解。这个问题只与质子化形式的FOA渗透细胞相一致。事实证明，FOA平板的标准配方是pH 2.8。这种酸度的一部分是由于FOA，而你的pH值较少，所以你的盘子的pH值必须略高一些。5-FOA在pH值为6或6.2时完全没有作用，在pH值为5.4时效果很好，在pH值为4或以下时完全有效。在与4%热琼脂混合之前，这是R.T.下的2倍过滤培养基。固化后，用pH棒/纸测量，板的pH值略高。

2.含有5-FOA的准备好的平板可以存放多长时间？

答：大多数实验室将5-FOA制备的平板储存数月（3-6个月）。我发现最长的储存时间是9个月，在4°C下储存超过12个月，没有干燥（用parafilm包裹）。

3.我应该使用多少5-FOA？

答：FOA（1mg/ml）已被用作酵母分子遗传学的选择剂；在Ura+细胞群中选择Ura细胞；以及在酿酒酵母的orotidine-5’-磷酸脱羧酶（OMPdecase）突变体的选择中。

FOA（0.1mg/ml）已用于硫依赖性嗜热古细菌酸性硫杆菌的尿嘧啶营养缺陷型的阳性选择。

参考文献

Kondo，S.等人，《细菌学杂志》，17376981991年。

Vidal，M.等人，Proc。Natl。Acad。Sci。美国，93，103211996。

Winston，F.等人，《遗传学》，1071791984年。

Boeke，J.D.等人，分子遗传学。，197, 345, 1984.

为了制备5-FOA，一些研究人员将该材料以约50 mg/mL的速度溶解在4 M氢氧化铵中，产生一种透明的溶液，并根据需要进行超声处理或加热。