原理与机制

5-HMSiR-Hoechst是一种双组分分子探针，由羟甲基硅罗丹明（HMSiR）荧光团与Hoechst双苯并咪唑DNA结合单元共价连接而成。在水溶液中，该染料主要以无荧光的闭环（螺内酯）形式存在，因此具有荧光生成特性：当探针与双链DNA富AT小沟结合后，平衡向开环高发光形式移动，从而激活荧光。这种荧光生成特性显著降低了未结合探针的背景荧光，并省去了洗涤步骤，极大简化了活细胞实验流程。

HMSiR荧光团在远红区发射（激发约650 nm，发射约670 nm），与常见的细胞自发荧光有效分离，并与商用STED系统通常使用的损耗激光（约775 nm）兼容。Hoechst靶向单元对染色质具有选择性高亲和力结合，能够在活细胞中实现纳米尺度核DNA结构的可视化。

试剂与仪器

• 5-HMSiR-Hoechst（H1450374）——用无水DMSO配制储液（如1–10 mM）；分装后避光保存于−20 °C。
• 适用于活细胞成像的培养基（无酚红，如FluoroBrite DMEM或同类产品）。
• 细胞培养耗材：35 mm玻底培养皿（No. 1.5盖玻片，0.17 mm）或同等高数值孔径兼容腔室。
• 配备约650 nm激发激光和约775 nm连续波或脉冲损耗激光的STED显微镜（如Leica SP8/SP8 LIGHTNING STED、Abberior STEDYCON或同类设备）。
• 高数值孔径油浸物镜（推荐≥1.4 NA）。
• 用于活细胞成像的温控和CO₂控制载物台插件。
• 无水DMSO（≥99.9%）用于配制储液。

注意：避免反复冻融。所有溶液全程避光。

分步染色与成像方案

1. 细胞准备

成像前24–48小时将细胞接种于玻底培养皿，使汇合度达60–80%。吸去培养基，更换预热（37 °C）的无酚红成像培养基。

2. 探针稀释与染色

将5-HMSiR-Hoechst储液用成像培养基稀释至工作浓度。活细胞STED的起始工作浓度通常为100–500 nM；请根据您的细胞类型和STED系统进行经验性优化。将工作液直接加入细胞，在37 °C、5% CO₂条件下孵育30–60分钟。由于该探针具有荧光生成特性，通常无需洗涤步骤；若希望进一步降低背景，可用成像培养基轻柔漂洗一次。

3. STED成像参数

将培养皿转移至预热的显微镜载物台。推荐起始参数：激发650 nm（激光功率5–10%），STED损耗775 nm（损耗功率50–100%，根据分辨率与光毒性平衡调整），探测窗口660–720 nm，线积分或帧积分4–8次。如有条件，使用时间门控探测（0.5–6 ns门控）可进一步提高信噪比。

4. 采集与活细胞注意事项

尽量缩短每个视野的总采集时间以减少光毒性。以核膜完整性、分裂期细胞形态等作为细胞活力指标进行监测。时间延迟实验时，建议降低损耗功率并延长帧间隔，以延长实验过程中的细胞存活时间。

常见问题排查

储存、操作与安全

储存：将冻干或固体5-HMSiR-Hoechst在−20 °C、干燥避光条件下保存。DMSO储液应密封保存于−20 °C；避免反复冻融（建议分装单次用量）。

操作：在弱光环境下称量和溶解。使用适当的个人防护装备（丁腈手套、实验服、护目镜）。DMSO会促进溶解物质经皮肤渗透——尽量避免工作液与皮肤接触。

稳定性：冻干物料在推荐储存条件下稳定期≥12个月。按上述方法保存的DMSO储液在−20 °C下稳定期≥6个月。水溶液工作液应新鲜配制，并在当天内使用。

废物处置：所有含染料废液应按当地化学废物法规处置。未经当地许可核实前，不得将荧光染料溶液直接倒入下水道。