细胞活力检测是研究人员广泛采用的一种方法，用于评估细胞的整体健康状况和功能性。这类检测在优化实验条件、深入了解细胞代谢以及评估特定处理的影响方面发挥着重要作用。本文将重点介绍 ATP 生物发光检测——一种利用 ATP、荧光素（luciferin）与荧光素酶（luciferase）相互作用来估算存活细胞数量的技术。

什么是 ATP 生物发光检测？

         ATP 生物发光检测基于这样一个原理：三磷酸腺苷（ATP）仅存在于代谢活跃的活细胞中，而一旦细胞死亡，其胞内 ATP 水平会迅速下降。通过检测依赖于 ATP 的生物发光信号，研究人员可以估算样品中存活细胞的数量。

         在含有 ATP 的活细胞中，荧光素–荧光素酶反应会产生可测量的光信号；相反，死亡细胞不含 ATP，因此不会产生生物发光信号。

         在受控条件下，发光强度与 ATP 浓度呈正比，而 ATP 浓度可作为样品中存活细胞数量的指标（Brovko, 2010）。

ATP 生物发光检测的工作原理

         该检测通过向细胞样品中加入荧光素酶及其底物荧光素来实现。由于荧光素酶反应依赖 ATP，只有代谢活跃（即活细胞）才能产生生物发光信号。

         死亡细胞的代谢被破坏，ATP 生成停止，而 ATP 酶（ATPase）在短时间内仍保持活性，从而快速分解胞内 ATP，导致不产生光信号。

         要深入理解此检测的基础原理，需要先了解 荧光素酶反应。

荧光素酶反应

         该反应主要包括两个步骤：

         1. 荧光素的腺苷化

• 消耗 ATP，将荧光素转化为荧光素腺苷酸（luciferyl adenylate）。

         2. 氧化脱羧

• 荧光素腺苷酸被氧化生成激发态的氧化荧光素（oxyluciferin）。
• 当氧化荧光素回到基态时，会释放出一个光子（Belanger & University of Rochester Introductory Biochemistry, 2018）。

         图 2. 萤火虫荧光素酶与 ATP 和 D-荧光素的基本反应。光的释放发生在激发态氧化荧光素回到基态时。

         该反应表明，ATP 是生物发光不可或缺的成分。由于 ATP 仅存在于活细胞中，研究人员可以利用该生化途径来定性和定量区分样品中的存活细胞与死亡细胞。

ATP 生物发光检测的应用

         ATP 生物发光检测是一种用途广泛的工具，广泛应用于科研和工业领域（Riss et al., 2016; Brovko, 2010），包括：

• 卫生状况评估
• 食品安全与加工检测
• 杀生剂剂量优化
• 发酵过程管理
• 细胞培养优化
• 实验条件优化
• 治疗效果评估
• 细胞毒性研究
• 受体结合测定
• 信号转导分析
• 致病性研究
• 肿瘤学研究
• 药物发现与开发

ATP 生物发光检测所用底物

         由于该检测基于荧光素酶反应，萤火虫荧光素是主要底物。

         然而，一些其他生物发光活力检测采用不同体系，例如 Renilla 和 Gaussia 荧光素酶检测使用底物 辅荧光素（coelenterazine）。

         Gaussia 体系的一个显著优点是其酶可被细胞分泌，便于体内检测并促进高通量筛选。但 Renilla 和 Gaussia 系统的主要限制是：其光发射波长（约 480 nm）在哺乳动物组织中容易被吸收和散射，导致深层组织体内成像的灵敏度降低（Brovko, 2010）。

ATP 生物发光底物的挑战

         萤火虫荧光素可以轻易穿过真核细胞膜，但由于在溶液中带负电荷，它在细菌细胞中的渗透性较差。应对这一问题的方法包括：

         1. pH 调节

• 将 pH 降至轻微酸性可使荧光素的羧基质子化，从而提高渗透性。
• 注意：pH 低于 5.0 会使荧光素酶失活。

         2. 多黏菌素 B（Polymyxin B）处理

• 多黏菌素 B 可在大肠杆菌膜上形成孔洞，方便荧光素进入。
• 需谨慎使用，高浓度可能对细胞致死。

         3. 笼状荧光素（Caged Luciferins）

• 这些改性、中性底物更容易穿透细菌细胞壁。
• 进入细胞后，可通过酶促作用或光激活转化为活性荧光素（Brovko, 2010）。

参考文献

AIB Staff. (2013, October 11). A Q&A on ATP Bioluminescence assay. 取自 2021 年 3 月 22 日, https://www.qualityassurancemag.com/article/aib1013-atp-bioluminescence-assay/

Belanger, S., & University of Rochester Introductory Biochemistry (Producers). (2018, May 15). Luciferase [视频文件]. 取自 2021 年 3 月 22 日, https://www.youtube.com/watch?v=odN92KbH8Bo

Brovko, L. (2010). Bioluminescence and fluorescence for in vivo imaging: In vivo optical imaging (Vol. TT91). Bellingham, WA, Washington: SPIE Press.

Riss, T., Moravec, R., Niles, A., Duellman, S., Benink, H., Worzella, T., & Minor, L. (2016). Cell Viability Assays. The Assay Guidance Manual.

阿拉丁：https://www.aladdin-e.com