稳定同位素标记物以²H、¹³C、¹⁵N或¹⁸O标记代谢底物，使其在体内的转化和去向能够被质谱或核磁共振识别。该技术可用于解析底物来源、代谢通路、器官间交换以及物质合成与周转。

        关键词：稳定同位素；体内代谢示踪；¹³C；¹⁵N；²H；¹⁸O；代谢通量

1 稳定同位素示踪的基本原理

1.1 稳定同位素示踪的研究价值

        常规代谢组学主要测定特定时间点的代谢物含量，可以发现代谢物水平的变化，但难以仅凭浓度判断其来源和代谢方向。同一代谢物浓度升高，既可能源于合成增强，也可能与降解受限或输出减少有关。稳定同位素示踪通过检测标记原子在不同代谢物之间的转移，将代谢研究从静态含量比较扩展至底物来源、通路连接和代谢流向分析。

1.2 示踪剂、被示踪物与同位素富集

（1）示踪剂与被示踪物

        示踪剂（tracer）是含有稳定重同位素的外源分子，被示踪物（tracee）是体内化学结构相同的未标记分子。标记分子与未标记分子具有相近的化学性质，可共同进入代谢网络，同时能够根据分子质量差异进行区分，使特定原子在下游代谢物中的转移过程得到记录。

（2）同位素富集

        同位素富集表示标记分子在目标代谢物池中的比例。外源示踪剂进入体内后与内源未标记底物混合，并在代谢过程中被逐步稀释或转移。检测血液和组织中不同代谢物的标记比例，可以分析底物的组织摄取、代谢转化和清除过程。

1.3 同位素体与同位素位置异构体

（1）同位素体

        同位素体（isotopologue）按照分子中重同位素原子的数量区分。以¹³C示踪的六碳代谢物为例，M+0表示未含示踪¹³C，M+1至M+6分别表示含有1～6个¹³C原子。不同M+n峰的比例构成质量同位素分布（mass isotopologue distribution，MID），可反映标记底物进入下游代谢物的程度。

（2）同位素位置异构体

        同位素位置异构体（isotopomer）含有相同数量的重同位素，但标记原子位于不同位置。例如，两个M+2代谢物可能分别在不同碳位携带¹³C，代表不同的原子转移路径。标记位置通常需要通过串联质谱、核磁共振或碳骨架衍生化分析确定。

1.4 常用稳定同位素

表1 体内代谢研究中常用的稳定同位素

2 稳定同位素示踪剂的标记策略

2.1 均一标记示踪剂

（1）标记特点

        均一标记（uniformly labeled，U-labeled）示踪剂在目标元素的全部相应位置引入稳定同位素，例如[U-¹³C₆]葡萄糖、[U-¹³C₅]谷氨酰胺和[U-¹³C₁₆]棕榈酸。此类示踪剂具有标记信号强、下游覆盖范围广的特点。

（2）主要用途

        均一标记示踪剂能够将标记原子同时转移至多个下游代谢分支，适合观察底物向糖酵解、磷酸戊糖途径、三羧酸循环、氨基酸、核苷酸和脂质等代谢池的总体分配，常用于构建整体代谢流向图谱。

2.2 位点特异性标记示踪剂

（1）标记特点

        位点特异性标记示踪剂只在预定原子位置引入重同位素。当标记碳在脱羧步骤中释放，或在碳骨架裂解后进入特定产物时，下游代谢物会形成具有通路特征的标记模式。

（2）主要用途

        不同碳位标记的葡萄糖可用于分析氧化型磷酸戊糖途径、非氧化型磷酸戊糖途径和糖酵解之间的碳流分配。分别使用[1,2,3-¹³C₃]果糖和[4,5,6-¹³C₃]果糖，还可以比较果糖前半部分与后半部分碳原子进入甘油、乳酸、葡萄糖和其他有机酸的差异。

2.3 双元素标记

（1）碳骨架示踪

        ¹³C/¹⁵N双标记氨基酸中的¹³C用于追踪碳骨架转化。以谷氨酰胺为例，五个¹³C可依次进入谷氨酸、α-酮戊二酸和三羧酸循环，用于分析谷氨酰胺分解、三羧酸循环补充反应及还原羧化。

（2）含氮基团示踪

        双标记氨基酸中的¹⁵N可用于分析转氨、核苷酸合成和氮排泄。谷氨酰胺含有氨基氮和酰胺氮，二者参与的反应不同；酰胺位点特异性¹⁵N标记谷氨酰胺更适合研究核苷酸合成中的酰胺氮转移。

2.4 水示踪

（1）²H₂O示踪

        ²H₂O进入体内后可迅速与体水池混合，²H经酶促反应进入新合成脂肪酸、胆固醇、核苷酸和蛋白质中的非交换性位点，适合研究脂质合成、细胞增殖和蛋白质周转。

（2）H₂¹⁸O示踪

        H₂¹⁸O可用于研究水来源氧原子的引入、特定水解反应和磷酸相关反应。与¹³C碳骨架示踪相比，H₂¹⁸O主要反映水分子中的氧原子是否参与目标反应。

2.5 示踪剂选择原则

表2 不同研究问题对应的稳定同位素示踪策略

3 稳定同位素在体内代谢研究中的主要应用

3.1 葡萄糖与中心碳代谢

（1）糖酵解与乳酸循环

        [U-¹³C₆]葡萄糖经糖酵解形成M+3丙酮酸和M+3乳酸。标记乳酸可进入循环，并被肝脏、心脏、骨骼肌及其他组织摄取，用于糖异生或氧化代谢。比较血浆与组织中葡萄糖、丙酮酸、乳酸及三羧酸循环中间体的同位素分布，可以分析葡萄糖碳在糖酵解、乳酸循环和氧化代谢之间的分配。

（2）磷酸戊糖途径

        葡萄糖C1可在氧化型磷酸戊糖途径的脱羧步骤中释放，其他碳位则具有不同的保留和重排模式。比较[1-¹³C]葡萄糖、[2-¹³C]葡萄糖或多位点标记葡萄糖产生的乳酸、核糖-5-磷酸及其他下游产物，可以分析氧化型与非氧化型磷酸戊糖途径的相对贡献。

（3）三羧酸循环

        葡萄糖来源的丙酮酸经丙酮酸脱氢酶转化为乙酰辅酶A后，可在首轮三羧酸循环中形成M+2柠檬酸等标记产物；丙酮酸经丙酮酸羧化酶生成草酰乙酸时，可形成M+3苹果酸、天冬氨酸和柠檬酸等同位素体。不同标记模式可用于分析丙酮酸氧化与三羧酸循环补充反应之间的碳流分配。

3.2 谷氨酰胺、氨基酸与氮代谢

（1）谷氨酰胺分解

        [U-¹³C₅]谷氨酰胺经谷氨酰胺酶形成M+5谷氨酸，再经谷氨酸脱氢酶或转氨反应形成M+5 α-酮戊二酸。标记碳沿三羧酸循环氧化后，可在琥珀酸、延胡索酸、苹果酸和天冬氨酸中形成M+4同位素体，用于评价谷氨酰胺对三羧酸循环的碳源贡献。

（2）还原羧化

        在缺氧、电子传递链受损或线粒体氧化代谢受限的条件下，α-酮戊二酸可经还原羧化生成异柠檬酸和柠檬酸，为脂质合成提供碳源。[U-¹³C₅]谷氨酰胺可形成M+5柠檬酸，并进一步在脂肪酸中产生相应标记，用于分析谷氨酰胺依赖的还原羧化。

（3）转氨与含氮代谢

        ¹⁵N标记谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸或精氨酸可用于分析氮在氨基酸、嘌呤、嘧啶和尿素循环中的转移。谷氨酰胺酰胺氮可进入嘌呤和嘧啶碱基，谷氨酸氨基氮可通过转氨反应进入天冬氨酸和丙氨酸，精氨酸中的标记氮可进入尿素、一氧化氮和鸟氨酸相关代谢物。

3.3 脂肪酸氧化与脂质合成

（1）脂肪酸摄取与β-氧化

        [U-¹³C₁₆]棕榈酸或[U-¹³C₁₈]油酸可用于追踪脂肪酸的组织摄取、β-氧化、重酯化和器官间运输。β-氧化逐轮释放M+2乙酰辅酶A，使标记进入三羧酸循环和酮体；完整标记脂肪酸进入甘油三酯、磷脂或胆固醇酯，则反映脂肪酸重酯化和脂质储存。

（2）新生脂肪酸合成

        [U-¹³C₆]葡萄糖和[¹³C₂]乙酸可通过乙酰辅酶A进入脂肪酸合成，使新生脂肪酸产生以M+2为基础的质量增量，适合分析脂质合成使用的碳源。²H₂O通过体水向脂肪酸的多个合成位点提供氢，可用于测定一定时间内新合成脂肪酸所占的比例。

（3）胆固醇合成与周转

        ¹³C标记乙酸或葡萄糖可用于分析乙酰辅酶A对甾醇骨架的碳源贡献，²H₂O可用于测定胆固醇新生合成比例，标记胆固醇可用于研究血浆脂蛋白转运、组织摄取、酯化及清除过程。

3.4 器官间代谢

        经口摄入的营养物可首先在胃肠道和肝脏中代谢，产生乳酸、葡萄糖、氨基酸及其他循环代谢物，再被远端组织利用。比较循环血液、器官引流静脉和不同组织中的同位素分布，可以分析肝脏、小肠、骨骼肌、脂肪组织和心脏之间的底物交换，并识别原始示踪剂经循环代谢物间接进入目标组织的过程。

3.5 肿瘤体内代谢

        肿瘤组织可利用葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、乙酸和脂肪酸维持能量生成及生物合成。向荷瘤动物输入相应的¹³C标记底物，并比较肿瘤、邻近正常组织和循环代谢物中的同位素分布，可以分析肿瘤的底物选择、三羧酸循环补充反应、还原羧化、核苷酸合成和脂质合成。

3.6 生物大分子合成与周转

        标记氨基酸掺入蛋白质可用于分析蛋白质合成和分解，²H₂O进入脱氧核糖、脂肪酸或蛋白质中的非交换性位点可用于研究细胞增殖、脂质生成和蛋白质周转。标记葡萄糖还可用于分析糖原和核糖合成，标记脂肪酸及甘油可用于研究甘油三酯和磷脂更新。

3.7 代谢性疾病与药物作用

        在糖尿病、肥胖和脂肪肝等代谢性疾病中，稳定同位素示踪可用于研究肝糖输出、外周葡萄糖利用、脂肪酸氧化、脂质合成和甘油三酯周转。比较干预前后的底物贡献、标记模式和周转速率，可以判断药物是否改变特定底物的利用或通路分配，并区分代谢物含量变化来自合成、分解、摄取还是清除过程。

4 稳定同位素信号的检测与结果解析

4.1 稳定同位素信号的检测

        稳定同位素不产生放射性，其示踪信号主要通过质谱（MS）和核磁共振（NMR）检测。质谱根据分子质量变化区分未标记代谢物与不同程度的标记代谢物，具有灵敏度高和检测范围广的特点；NMR能够提供标记原子的位置信息，适合分析碳骨架重排和特定代谢反应。

4.2 同位素体标记模式

        不同M+n峰的比例共同构成质量同位素分布，可反映标记底物进入下游代谢物的程度和碳、氮骨架的转移方式。原始结果通常需要校正天然同位素丰度，并结合示踪剂纯度、前体富集程度、代谢物含量和采样时间进行分析。

4.3 体内示踪结果的基本判读

        下游代谢物出现标记，表明示踪底物中的原子已经进入该代谢物，但标记比例不能直接等同于代谢通量。体内存在器官间交换和循环代谢，例如标记葡萄糖可先转化为标记乳酸，再由其他组织摄取。只有结合前体富集、代谢物含量、动态采样和必要的代谢模型，才能进一步判断标记来源、通路贡献和代谢通量。

5 稳定同位素示踪相关产品

5.1 糖代谢、三羧酸循环及短链碳源示踪相关产品

5.2 氨基酸、氮代谢及蛋白质周转示踪相关产品

5.3 脂质合成、体水及其他代谢示踪相关产品

        稳定同位素示踪可解析体内底物来源、通路分配和代谢周转。随着高分辨质谱、空间代谢组学和动态通量模型的发展，其应用将进一步扩展至组织异质性、器官间代谢协作和疾病代谢重编程。

参考文献

[1] Fernández-García J, Altea-Manzano P, Pranzini E, Fendt SM. Stable Isotopes for Tracing Mammalian-Cell Metabolism In Vivo. Trends Biochem Sci. 2020 Mar;45(3):185-201

[2] Jang C, Hui S, Lu W, Cowan AJ, Morscher RJ, Lee G, Liu W, Tesz GJ, Birnbaum MJ, Rabinowitz JD. The Small Intestine Converts Dietary Fructose into Glucose and Organic Acids. Cell Metab. 2018 Feb 6;27(2):351-361.e3.

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[1] 生物分子NMR：蛋白质动力学研究的同位素标记法

[2] 稳定同位素入门：给分子加“隐形条形码”，让定量、示踪与溯源更可靠（附选型导航及产品表1-3）

[3] 稳定性同位素的应用