材料与储备液配制

AZD4320（产品编号：A607867）以固体粉末形式供货。使用前，请配制高浓度储备液，以便在后续实验中准确取样。

1. 称量化合物：开瓶前，将密封瓶置于室温平衡约15–30分钟，防止粉末吸潮。
2. 溶于DMSO：将AZD4320溶于无水DMSO，推荐配制浓度为10 mM。轻柔涡旋混匀，如溶解困难可短暂于37 °C水浴助溶。请勿直接使用水相缓冲液溶解，因该化合物水溶性有限。
3. 分装与保存：将储备液分装至单次用量的微量离心管中，密封后标注配制日期和浓度，于-20 °C避光保存。避免反复冻融（建议冻融次数不超过3次）。
4. 工作液配制：使用前即刻将储备液稀释于细胞培养基或实验缓冲液中。实验孔中DMSO终浓度不应超过0.1%（v/v），以降低溶剂细胞毒性。同时设置相同溶剂浓度的空白对照（仅含DMSO）。

注意：如需精确定量，建议通过紫外吸收或HPLC对化合物纯度和浓度进行验证。具体溶解度数值请以每批次所附合格证书（CoA）为准。

细胞培养与处理方案

AZD4320适用于多种贴壁及悬浮培养的肿瘤细胞系。以下方案提供通用操作框架，请根据具体细胞模型进行优化。

细胞铺板

• 在处理前24小时，将细胞以适当密度接种于96孔板（活力检测）或6孔板（Western blot、流式细胞术）中，使其充分贴壁并达到平衡状态。
• 于37 °C、5% CO₂条件下，在推荐的完全培养基中维持细胞培养。

化合物处理

1. 在预热的完全培养基中配制AZD4320工作液梯度稀释系列（例如0.001–10 µM）。
2. 吸去孔中原有培养基，替换为含AZD4320或溶剂对照的处理液。
3. 按所需时长孵育细胞。典型处理时间为6–72小时，具体视检测终点而定：早期凋亡标志物检测适合6–24小时，细胞活力读数适合48–72小时。

阳性与阴性对照

• 阴性对照：加入等体积DMSO溶剂的细胞。
• 阳性对照：适合所用细胞系的已知凋亡诱导剂（例如1 µM星形孢菌素处理4小时）。

注意：AZD4320的有效浓度因细胞系及BCL-2/BCL-XL表达水平而异。在确定固定浓度前，强烈建议先进行剂量–效应实验。

细胞凋亡与活力检测方法

可采用多种互补检测方法对AZD4320诱导的细胞凋亡和细胞毒性进行定量分析，请根据实验目的选择合适的检测方案。

细胞活力检测（ATP生物发光法）

ATP生物发光试剂（如CellTiter-Glo）可快速定量检测代谢活跃的细胞数量。化合物孵育结束后，按照试剂说明书加入检测试剂，测定发光值，并相对于溶剂对照计算存活率百分比。通过非线性回归拟合确定IC₅₀值。

Annexin V / 碘化丙啶（PI）流式细胞术

该方法可区分存活、早期凋亡、晚期凋亡及坏死细胞群体。处理结束后，收集漂浮及贴壁细胞，用冷PBS洗涤，按试剂盒说明书用Annexin V–FITC和PI染色，并在染色后1小时内上机检测。

Caspase-3/7活化检测

Caspase-3和-7是内源性凋亡途径中的效应酶。可使用发光底物试剂盒或抗裂解型Caspase-3抗体免疫荧光法，确认BCL-2/BCL-XL抑制后下游凋亡信号的激活。

Western blotting

通过检测BCL-2和BCL-XL蛋白表达、细胞色素c释放，以及PARP或Caspase-9的切割，作为确认靶点活性的机制标志物。使用含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液收集细胞裂解物。

安全注意事项、废弃物处理与问题排查

安全注意事项：AZD4320为仅限科研使用（RUO）化合物。与所有具有强生物活性的小分子化合物一样，操作时须穿戴适当的个人防护装备（PPE），包括实验服、丁腈手套和护目镜。配制DMSO储备液时应在通风良好的环境或化学通风橱中进行。使用前请阅读随产品提供的安全数据表（SDS）。

废弃物处理：含AZD4320的溶液及污染材料应按照所在机构及法规关于危险化学废物的相关规定进行处置，切勿将高浓度溶液直接倒入下水道。

问题排查指南