产品名：叠氮-PEG3-马来酰亚胺

         化学结构：

         分子式: C15H23N5O6 

         分子量: 369.4 

         溶解性：DMSO、DMF、DCM 

         外观：小瓶 1 类白色至灰色固体；小瓶 2 微黄色油状物

         储存： 收到产品后存放在 -20°C 下。产品在环境温度下运输 

         保质期：每种成分在零下 20℃条件下至少 12 个月

         重要提示：Azido-PEG3-马来酰亚胺在室温下会迅速降解（数小时）。本产品为双组分试剂盒。叠氮-PEG3-马来酰亚胺的储备溶液在原位制备。

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简介

         叠氮-PEG3-马来酰亚胺主要用于将两种生物分子交联在一起。马来酰亚胺与含硫醇的化合物在 pH 值为 6.5 至 7.0 的条件下发生反应，使分子活化，然后叠氮化物与含炔化合物发生反应，生成共轭物。

注：

         - 硫醇-马来酰亚胺反应的 pH 值： 6.5-7.5. 

         马来酰亚胺基团主要与游离的巯基反应生成硫醚。当 pH 值大于 7.0 时，伯胺也会与马来酰亚胺发生反应，马来酰亚胺基团会发生水解。在 pH 值为 7 时，马来酰亚胺基团对游离巯基的反应活性是对胺的反应活性的约 1000 倍。

         - 无硫醇和叠氮：生物分子和缓冲液中无硫醇和叠氮残留。

所需的其他材料

         - 助溶剂：二甲基亚砜（DMSO）或二甲基甲酰胺（DMF）

         - 还原试剂： TCEPT 或固定化 TCEP 二硫化物还原凝胶

         - 反应缓冲液： PBS 缓冲液（pH 6.5-7.0），含 5-10 mM EDTA

         - 可选）淬火缓冲液：浓缩（0.5-1 M）半胱氨酸、DDT 或其他含硫醇的还原剂

         - 旋转脱盐柱

制备叠氮-PEG3-马来酰亚胺储备溶液

         1. 向叠氮-PEG3-胺（2 号瓶）中加入 2.5 毫升干燥的 DMF 或 DMSO，摇晃约 30 秒。

         2. 在干燥的 N2 气氛下，将上述溶液缓慢加入马来酰亚胺-NHS 酯（1 号瓶，白色固体）中，在室温下搅拌 30 分钟。反应的进展情况可通过 TLC 进行观察。

         3. 叠氮-PEG3-马来酰亚胺的储备溶液即可使用。在此阶段，如果在 -20C 或更低温度下短期（数小时）储存，产品是稳定的。

         4. 叠氮-PEG3-马来酰亚胺储备溶液的浓度约为 120 mM，即为 0： 0.3 毫摩尔。

         5. TLC 数据：甲醇：二氯甲烷 1:20 或 4 毫升： 10 滴，硅胶正相平板，高锰酸钾喷雾显影。

         例如，叠氮-PEG3-马来酰亚胺的 Rf 值略低于马来酰亚胺-NHS 酯。反应完成后，平板上会出现一个干净的斑点。

标记蛋白质的步骤

         1. 如有需要，可使用旋转脱盐柱将蛋白质样品缓冲液交换到 1-5 mg/mL 的 PBS 中。

         2. 在蛋白溶液中加入最终浓度为 20 mM 的 TCEP 原液，用移液管上下移动数次使其混合。

         3. 孵育反应 30 分钟。

         4. 将缓冲液置换到反应缓冲液中，以去除多余的 TCEP。

         注：需在反应缓冲液中加入 EDTA，最终浓度为 5-10 mM，以避免 S-S 结合重构。

         5. 在蛋白质样品中加入 20 x 上述新鲜制备的马来酰亚胺试剂。

         6. 将反应混合物在室温下孵育 1-4 小时，或在 4°C 下孵育 2-8 小时。

         注意：当 DMF 或 DMSO 浓度超过最终反应体积的 10%时，许多蛋白质会沉淀。

         7. 通过旋转脱盐柱脱盐或透析去除多余的试剂。

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