图 1. BCN - 叠氮化物连接反应示意图

条件 1：EtOH/ H2O（3:2），室温
条件 2： 二甲基亚砜/水，室温

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          BCN 试剂是一类点击化学标记试剂。BCN 基团能专门与叠氮标记分子或生物分子反应，形成稳定的三唑。点击化学也被称为应变促进炔吖环加成（SPAAC），BCN 试剂已广泛应用于生物共轭、标记和化学生物学领域。

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          BCN 点击化学可在水性缓冲液或有机溶剂中进行，具体取决于底物分子的性质。

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         这种方法需要用 BCN 试剂激活 1 号生物分子，用叠氮化物激活 2 号生物分子，然后将两种激活的生物分子混合形成共轭物。

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特点
         - 生物相容性--无需具有细胞毒性的铜催化剂--适合体内应用。
         - 条件温和--可在水性缓冲介质中和低温下共轭 - 稳定性--BCN 和叠氮分子长期稳定
         - 效率--可形成定量的稳定三唑
         - 特异性和生物正交性 叠氮化物仅在-NH2、--COOH 和其他蛋白质官能团存在的情况下与 BCN 发生反应；
注：硫醇会与 BCN 发生反应，β-巯基乙醇（β-ME）会抑制硫醇与 BCN 的加成反应。

实验方案：（抗体-oligo 连接）
活化抗体
          - 将抗体与 20-30 倍摩尔过量的溶于二甲基亚砜的 BCN NHS 酯（10 mM 溶液）混合。最终混合物中的 DMSO 含量应在 20% 左右，反应混合物中的抗体浓度应在 1 mg/mL 左右。
          - 室温下孵育 60 分钟。
          - 在反应中加入 Tris（10 uL，100mM 水溶液）以淬灭未反应的 DBCO-NHS 酯。
          - 孵育 15 分钟。
          - 使用旋转脱盐柱去除未反应的 BCN-NHS 酯。
注：BCN 功能化抗体可在 -20°C 下保存数月。

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共轭
          - 将 BCN 功能化抗体或其他生物大分子与 2-4 倍摩尔过量的叠氮修饰寡核苷酸或叠氮功能化染料混合。
          - 室温下孵育过夜。
          - 使用 SDS 凝胶电泳验证最终共轭物
          - 使用液相色谱法（反相高效液相色谱法、离子交换高效液相色谱法或两者兼用）去除未反应的寡核苷酸或染料。

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