生物素定量试剂盒概述
          BroadPharm 生物素定量试剂盒可快速估算生物素与蛋白质的摩尔-摩尔比。要量化生物素标记的结合，可将含有生物素化蛋白质的溶液加入 HABA 和阿维丁的混合物中。由于生物素与阿维丁的亲和力较高，因此生物素会取代 HABA 与阿维丁的相互作用，500 纳米波长处的吸收也会相应减少。利用这种方法，只需在一个比色皿中测量加入含生物素样品前后 HABA-avidin 溶液的吸光度，即可评估溶液中未知量的生物素。吸光度的变化与样品中生物素的含量有关。

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          请参阅 BroadPharm 试剂盒 Sulfo-NHS-LC 生物素试剂盒 (BP-50058)、Sulfo-NHS 生物素 (BP-50056) 和 NHS-PEG4 生物素 (BP-50054)，以满足您的生物素化需求。

重要产品信息 
          - 在进行定量检测前，必须对生物素标记的蛋白质进行脱盐或透析，以去除所有非反应性和水解的生物素化剂痕迹。
          - 样品必须在推荐的缓冲液（PBS 或 TBS，见试剂制备部分）中进行检测。避免使用含钾的缓冲液（如改良的 Dulbecco's PBS），否则会在检测中产生沉淀。除非首先与 PBS 或 TBS 的结果进行比较验证，否则不应使用可能干扰标记的缓冲液。
          - HABA-avidin预混微管之间的微小颜色差异不会影响产品性能。

A. 试剂制备

          - 让所有成分达到室温。

          - 加入 1 毫升去离子水重组一小瓶 HABA-avidin 预混液（A 组份），混合，等待 5 分钟，然后再次混合。脉冲旋转离心机将液体带到小瓶底部。

          - 建议蛋白质样品大小为 ~ 100 kD，浓度为 1 mg/ml，生物素与蛋白质的比例为 5x。

          注：未使用的 HABA-avidin 溶液在 40C 温度下可稳定 2 周。

B. 定量程序：

          用于定量每摩尔蛋白质中生物素摩尔数的比色皿格式

          1. 在 1 毫升比色皿中加入 900 微升上述重配的 HABA-avidin 溶液。在 500 纳米波长处检测，记录为 A0。

          2. 将 100 μl 生物素化蛋白质样品加入到含有 HABA-avidin 的比色皿中，混匀（确保比色皿壁上没有气泡）。等待 2 分钟，在 500 纳米波长下检测样品并记录数值 A1。(如果读数≤ 0.3，请稀释样品并重复检测。）

          微孔板定量每摩尔蛋白质中生物素的摩尔数

          1. 在微孔板孔中，加入 180 μl 重构的 HABA-avidin 预混液 + 20 μl 1x PBS 或水，用微量移液器轻轻上下移动混合，或使用轨道摇床 400 rpm，1 分钟。

          2. 在另一孔中加入 180 μl 重构的 HABA-avidin 预混液 + 20 μl 生物素化蛋白质样品，用微量移液器轻轻上下移动，或使用轨道摇床 400 rpm，1 分钟。该孔的读数将记录为 A1（读数说明步骤 4）。

          3. 允许两分钟的等待时间。

          4. 同时读取两个孔的吸光度，波长为 500 纳米。

备注
C. 每摩尔蛋白质生物素摩尔数的计算

          - A0：HABA/avidin 反应混合物在 500 纳米波长处的吸光度
          - A1：HABA/avidin/生物素反应混合物在 500 纳米波长处的吸光度
          - 34000 是 HABA/avidin 样品在 500 纳米波长处的吸收率或消光系数。
          - b 是样品池路径长度，单位为厘米（cm）。10 毫米见方的比色皿的路径长度为 1.0 厘米。在推荐容量的微孔板格式中，路径长度通常为 0.5 厘米。
          - C 是样品浓度（毫克/毫升）。
          - MW：蛋白质的分子量（MW）（例如，HRP = 40,000；IgG = 150,000）。
          - DF：稀释因子，如果样品在加入 HABA/avidin 反应混合物前已稀释。DF = 1，如果生物素化蛋白质未在上述给定程序之外稀释。

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