1、简介

1.1培养基基本要求

1.1.1营养成分

细胞在体外生长需要基本的营养条件，包括：

1.       氨基酸

氨基酸是细胞合成蛋白质的原料。所有的细胞都需要十二种必需氨基酸：精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸和缬氨酸，它们是L-氨基酸。此外，谷氨酰胺是另一种在细胞代谢过程中起重要作用的成分。谷氨酰胺中所含的氮元素不仅是核酸中嘌呤和嘧啶的来源，而且是合成三、二、单磷酸苷的必需物质。

2.  单糖

培养的细胞以己糖的有氧糖酵解和无氧糖酵解为主要能源。此外，己糖还用于一些氨基酸、脂肪和核酸的合成。不同单糖的细胞吸收能力不同，葡萄糖最高，半乳糖最低。

3.       维生素

维生素主要在细胞代谢过程中充当辅酶或辅酶基团。生物素、叶酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素和维生素 B12 是培养基中的常见成分。

4.       无机离子和微量元素

除了一些基本元素（包括钠、钾、钙、镁、氮和磷），细胞生长还需要一些微量元素，如钼、钒、铁、锌和硒、铜、锰。

1.2生长激素和激素

体内生长的细胞总是受生长抑素和激素的调节。许多研究表明，各种生长激素和激素对维持细胞功能和状态（分化或未分化）非常重要。一些激素对不同类型的细胞有促进生长的作用。例如，胰岛素可以促进细胞中葡萄糖和氨基酸的使用。一些激素是细胞类型特异性的，如氢化可的松，可以促进表皮细胞的生长，催乳素，诱导乳腺上皮细胞的增殖。

1.3渗透压

细胞需要等渗环境，人血浆渗透压约为290mosm/kg，这被认为是培养人细胞的理想渗透压。小鼠血浆渗透压约为320毫微秒/千克。渗透压260-320毫微秒/千克适合大多数哺乳动物细胞。

1.4 pH值

大多数细胞的适宜pH值为7.2-7.4；否则会产生有害影响。培养基应具有一定的缓冲能力。引起pH变化的主要物质是细胞代谢过程中产生的CO2。在密闭环境中，CO2可以与H2O2结合生成碳酸，从而降低介质的pH值。合成介质采用NaHCO3-CO2缓冲系统来解决这个问题。在缓冲系统中，[H+]的增加增加了反应速率H++盐=>弱酸，并使一些H+退出循环。它基于恒定平衡。

2.天然培养基

自然培养基是指动物体液或组织提取的培养基，包括血浆、血清、淋巴、鸡胚浸出液。天然培养基含有丰富的营养素、各种生长激素和激素，渗透压和pH值与人体环境相似。由于该培养基具有非常复杂的生产过程和较大的批次间变化，因此该培养基逐渐被合成培养基所取代。今天，血清仍然是广泛使用的天然培养基。

2.1血清

 2.1.1血清类型

血清可以来自不同的动物。目前用于组织培养的血清是牛血清。人血清、马血清用于某些特定细胞。牛血清用于细胞培养具有资源充足、制备技术成熟、应用时间长等优点。牛血清包括小牛血清、新生小牛血清和胎牛血清。从Gibco Life Technologies公司采集牛血清样本，胎牛血清来源于剖腹产胎牛；新生小牛血清来自24小时内出生的新生小牛；小牛血清来自10到30天的小牛。胎牛血清质量最高，因为胎牛不暴露于外界环境，抗体和补体最低。

2.1.2血清的主要成分及其功能

血清是从血浆中除去血白素制成的，含有各种血浆蛋白质、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素和无机矿物质等。所有这些物质都保持着促进或抑制细胞生长的生理平衡。下表显示了血清的主要成分及其平均浓度。

表1血清的主要成分及其平均浓度。

血清的主要功能如下：

a、  提供必需营养素

血清中含有各种氨基酸、维生素、无机矿物质、脂肪和核酸衍生物，这些都是细胞生长所必需的营养素。

b、  提供粘附和扩展因子

许多体外培养的细胞必须附着培养血管才能生长，这取决于细胞外基质。细胞在体内可以分泌细胞外基质，但这种能力会随着传代次数的增加而降低甚至消失。血清中含有一些成分（纤维连接蛋白、层粘连蛋白等），可以促进细胞粘附。

c、  提供激素和各种生长因子

血清中含有多种激素，如胰岛素、肾上腺皮质激素（氢化可的松、地塞米松）、类固醇激素（雌二醇、睾酮和孕酮）等。生长因子包括成纤维细胞生长因子（FGF）、表皮生长因子（EGF）、特异性生长因子（PDGF）等。

d、  提供结合蛋白

结合蛋白携带低分子量物质。例如，白蛋白携带维生素、脂肪（脂肪酸、胆固醇）和激素。转铁蛋白携带铁。

e、  为某些特定细胞提供保护

一些细胞（如上皮细胞、髓样细胞）可以释放蛋白酶，可被血清中的抗蛋白酶成分中和。血清广泛用于终止胰蛋白酶的作用。血清白蛋白促进血清粘度并保护细胞免受机械损伤，尤其是在悬浮细胞培养中。微量元素和离子，如SeO3和硒，在代谢解毒中起着非常重要的作用

2.1.3组织培养中使用血清的缺点

血清成分复杂，包括有利成分和不可避免的有害成分。在组织培养中使用血清的缺点如下。

a、 对于大多数细胞来说，血清在体内不是生理流体。在损伤愈合或血液凝固过程中，细胞仅与血清接触。因此，血清的利用可能会改变某些细胞的正常状况。血清可能促进某些细胞（如成纤维细胞）的生长，并抑制其他细胞（如表皮角质形成细胞）的增殖

b、 某些成分可能对细胞有毒。以多胺氧化酶为例，它可以与多胺（如精胺和亚精胺）反应，在高度增殖的细胞中形成有毒的聚精胺。此外，补体、抗体和细菌毒素会影响细胞生长，甚至导致细胞死亡。

c、 每批血清各不相同，成分不能保持均匀。

d、 生产过程可能感染支原体或病毒，这可能影响细胞，导致实验失败和实验结果不可靠。

2.2鼠尾胶原蛋白

鼠尾胶原蛋白，用作组织培养表面的薄层以增强细胞附着和增殖，或用作凝胶以促进细胞特定形态和功能的表达。该产品非常适合表面涂层，为培养细胞提供薄层制备，或用作固体凝胶。鼠尾胶原蛋白适用于多种细胞系，包括肝细胞、成纤维细胞和上皮细胞

3．合成介质

合成培养基是人工设计和制备的培养基。如今，合成培养基已成为品种繁多、使用方便的标准化商品。

3.1基本介质

3.1.1基本部件

经过实验筛选，最简单的培养基是最小基本培养基（MEM），它含有20多种物质，可分为4个亚组。

无机盐：CaCl2、KCl、MgSO4、NaCl、NaHCO3、NaH2PO4

氨基酸：精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸和缬氨酸。

维生素：部分多金属氧酸钙、氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、吡哆醇、核黄素、硫胺

碳水化合物：葡萄糖

除上述与细胞生长有关的物质外，培养基通常还使用酚红作为pH指示剂。

MEM不是常见的基本介质，常见介质有30多种成分，如RPMI1640、DMEM等。这些培养基通常添加一些非必需氨基酸和维生素，包括丝氨酸、脯氨酸、生物素、维生素B12等。

3.2类别

如今，有十多种基本介质可用。最常见的是：

a、  MEM公司

MEM，也称为Eagle的最小基本培养基，是由Harry Eagle开发的细胞培养基，可用于维持组织培养中的细胞。它只含有12种非必需氨基酸、谷氨酰胺、8种维生素和一些碱性无机盐

b、 DMEM

MEM的一种变体，称为Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），（Dulbecco/Vogt改良Eagle最小基本培养基），含有原配方中维生素和氨基酸的大约四倍，葡萄糖的大约两到四倍。DMEM又分为高糖型（4500g/L葡萄糖）和低糖型（1000g/L葡萄糖）。高糖DMEM适用于一些生长速度较快且难以附着的肿瘤细胞，因为它有利于在一个地方保留和生长。

c、 IMDM

它由Iscove basic DMEM改良，包含42种成分。它包括硒以及额外的氨基酸和维生素。此外，这种独特的培养基缺乏铁，用硝酸钾代替硝酸铁。它非常适合难以增殖的低密度细胞培养，包括细胞融合后的杂交细胞选择，DNA转染后的转化细胞选择。

d、 RPMI1640

罗斯威尔公园纪念研究所培养基，通常称为RPMI，是一种用于细胞培养和组织培养的培养基。初始配方适合悬浮细胞的生长，主要是淋巴细胞。这种培养基含有大量磷酸盐，适合在5%的二氧化碳气氛中使用。RPMI1640是最成熟的改良培养基，适用于大多数类型的细胞，包括肿瘤细胞、正常细胞、原代培养细胞、传代细胞。RPMI1640是最常用的介质之一。

e、 199/109中等

199培养基是由Morgan及其同事于1950年开发的最早的培养基之一。它最初是作为鸡胚细胞培养的完全定义的培养基配方开发的。199培养基含有60多种成分，几乎包含所有氨基酸、维生素、生长激素、核酸衍生物等。109培养基是在199培养基的基础上改进的，更适合在无血清环境中进行细胞培养。

f、   HamF10/HamF12

哈姆的F-10培养基是哈姆1962年设计的经典培养基，用于支持小鼠和人类二倍体细胞的生长。哈姆的F-12作为改良产品，已用于原代大鼠肝细胞和大鼠前列腺上皮细胞的生长。还报告了使用CHO细胞进行克隆毒性试验，并选择Ham的F-12作为培养基。Ham的F-12也有25毫米HEPES缓冲液，在7.2-7.4的合适pH范围内提供更有效的缓冲

g、  麦考伊5A

1959年，McCoy和他的同事报告了体外培养Novikoff肝癌细胞所需的氨基酸。这些研究是使用基础培养基5A进行的，随后进行了修改，以创建一种称为McCoy的5A培养基的新培养基。该培养基用于支持来自肾上腺、骨髓（正常）、牙龈、肺、小鼠肾脏、网膜、皮肤、脾脏和其他组织的原代培养物的生长。它是原代和已建立细胞系的通用培养基。

所有这些介质都已商业化，其中一种介质有不同的形式，如粉末或液体、大包装或袋装。液体形式细分为10倍浓溶液、2倍浓溶液和工作溶液。有些培养基不含酚红，有些培养基不含钙离子和镁。用户可以根据实验要求选择产品。部分介质的基本成分如下：

无机盐

氨基酸

维生素

其他化学品：

表2.某些介质的基本成分（mg/L）

3.3无血清培养基

无血清培养基（SFM）是重要的工具，使研究人员能够在没有血清的情况下生长特定类型的细胞或执行特定的应用。

3.3.1.使用无血清培养基的优点包括：

a、 更容易净化和下游处理

b、 细胞功能的精确评估

c、 增加了定义

d、 更一致的性能

e、 增长和/或生产力提高

f、 更好地控制生理反应性

g、 增强对细胞介质的检测

3.3.2无血清培养中需要考虑的事项

总的来说，无血清培养的细胞对极端的pH、温度、渗透压、机械力和酶处理更敏感。

a、 抗生素

最好不要在无血清培养基中使用抗生素。如果你这样做，我们建议你使用比在补充血清的培养基中少5到10倍。这是因为血清蛋白倾向于结合添加的一定量的抗生素；如果没有这些血清蛋白，抗生素水平可能对某些细胞有毒。

b、 更高密度

在适应之前，细胞必须处于生长的中对数阶段，活力>90%。可能需要顺序自适应。

在SFM适应期间，在每个通道以高于正常密度的接种培养物可能有助于这一过程。由于某些百分比的细胞可能无法在新的培养环境中存活，因此存在更多的细胞将增加可继续传代的活细胞数量。

c、 结块

在适应SFM的过程中，经常发生细胞聚集。我们建议您在传代细胞时轻轻研磨团块以将其分解。

d、 形态学

在适应SFM期间和之后，细胞形态发生轻微变化并不罕见。只要倍增时间和生存能力保持良好，形态的轻微变化就不应引起关注。

3.4无血清培养基的基本配方

SFM包括基本培养基和补充剂。基本培养基通常使用HamF12和DMEM作为1:1的混合物。补充内容包括：

a、 促进粘附物质

体外培养的许多细胞需要贴附培养血管才能生长，SFM需要添加一些添加剂以促进贴附和延伸，主要是细胞外基质（纤维连接蛋白、层粘连蛋白等）。

b、 生长激素和激素

不同的生长因子需要添加不同的细胞。例如，表皮生长因子用于角质形成细胞，神经生长因子用于神经细胞，内皮生长因子用于内皮细胞。下表总结了一些生长因子的利用情况。

c、 酶抑制剂

粘附细胞需要胰蛋白酶化和传代。SFM必须具有酶抑制剂，以停止胰蛋白酶的活性并保护细胞。最常见的酶抑制剂是大豆胰蛋白酶抑制剂

d、 结合蛋白和转运体

常见的结合蛋白和转运体是转移蛋白和牛血清白蛋白。

e、 微量元素

硒是最常见的微量元素。

4、如何使用

顺序适应是使细胞适应无血清培养基（SFM）的首选方法。因为从75%到100%的SFM变化可能对你的细胞来说压力太大，所以你可能需要在10%血清补充培养基中携带细胞2-3代：90%SFM混合物。在100%SFM中传代3代后，大多数细胞系可以被视为完全适应。有时，即使在进行100%SFM之前，您的细胞也可能无法通过某个步骤。如果发生这种情况，则返回并按之前添加血清的培养基与无血清培养基的比例传代细胞2-3次。

表3.某些生长因子的利用

4.1无蛋白培养基（PFM）和化学定义培养基（CDM）

无蛋白培养基（PFM）是一种专有的无血清和无蛋白生长培养基，不含任何激素或生长因子。除了该亲本系的许多衍生物外，该培养基还适用于培养中国仓鼠卵巢（CHO）细胞。培养基中不含蛋白质可以消除任何血液传播疾病的风险，从而生产出比市场上现有培养基安全得多的产品。

化学定义介质（CDM）是一种已知所有成分的化学性质及其数量的介质。

5．其他介质

5.1平衡盐溶液（BSS）

平衡的盐溶液可以在体外提供一个维持细胞结构和生理完整性的环境。溶液通常包括钠、钾、钙、镁和氯化物。平衡盐溶液用于清洗组织和细胞，通常与其他药剂结合处理组织和细胞。它们为细胞提供水和无机离子，同时保持生理pH值和渗透压。下表列出了几种常见基站的公式。

表4.几种常见BSS的公式

5.2消化用培养基

原代细胞培养通常需要消化和分离组织-细胞悬浮液。连续传代培养需要消化培养皿中的粘附细胞。常见的消化液有胰蛋白酶、EDTA溶液和胶原酶溶液。

5.2.1胰蛋白酶

在组织培养实验室中，在收集细胞的过程中，使用胰蛋白酶重新悬浮粘附在细胞培养皿壁上的细胞。胰蛋白酶用于切割将培养细胞与培养皿结合的蛋白质，使细胞悬浮在新鲜溶液中并转移到新鲜培养皿中。

胰蛋白酶是一种由哺乳动物胃肠产生的内肽酶，其合适工作pH值约为8，合适工作温度约为37℃。对胰蛋白酶1:250进行的生化分析确定了影响细胞去除和活力的某些共纯化酶的胰蛋白酶比活性

5.2.2 EDTA溶液

在细胞培养应用中，EDTA的螯合特性可与钙和其他离子结合，从而防止细胞间钙粘蛋白（即参与钙依赖性细胞粘附的完整膜蛋白）的邻接，防止在液体悬浮液中生长的细胞结块，甚至分离粘附细胞进行传代。工作浓度为0.02%。胰蛋白酶/EDTA是一种分离细胞的联合方法。

5.2.3胶原酶溶液

当组织过于纤维化或过于敏感而不允许使用胰蛋白酶时，胶原酶尤其有价值，胰蛋白酶对纤维材料无效，并对敏感材料有害。分离通常通过灌注整个器官或用酶溶液培养较小的组织块来实现。工作溶液为0.1-0.3mg/ml或200000U/L。合适操作pH值约为6.5。

5.3 pH调节介质

5.3.1 NaHCO3溶液

碳酸氢钠用作缓冲系统的一部分，通常用于在培养环境中保持生理pH值7.2-7.4。介质中碳酸氢钠的浓度必须与介质上方大气中的CO2水平相匹配。对于含有1.5至2.2 g/L碳酸氢钠的介质，使用5%的CO2。对于含有3.7 g/L碳酸氢钠的介质，使用10%的CO2。

5.3.2 HEPES

HEPES（4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸）是一种两性离子有机化学缓冲剂。细胞培养基中的HEPE水平可能在10mM到25mM之间。当细胞培养需要在CO2培养箱外长时间操作时，仅将其添加到培养基中以增加缓冲能力。

5.4抗生素

研究人员使用抗生素和抗真菌药物来防止污染。常见的是青霉素和链霉素（P/S）。青霉素-链霉素混合物含有5000单位青霉素（碱）和5000μg链霉素（碱）/ml，利用青霉素g（钠盐）

硫酸链霉素在0.85%生理盐水中。下表总结了不同抗生素的使用情况。

表5.抗生素储存条件培养物中的工作浓度稳定性（37°C）

5.5谷氨酰胺

谷氨酰胺是细胞培养基配方中所需的一种不稳定的必需氨基酸。大多数市售培养基均含有游离L-谷氨酰胺，游离L-谷氨酰胺包含在基本配方中，或在使用时添加到液体配方中。经典培养基中使用的L-谷氨酰胺浓度通常为0.002mol/L。

6．参考文献

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