切割膜，装载样品，堵塞

1.根据样品量切割8 cm×6 cm硝化纤维素膜。每1cm轻轻画一条直线参考线，将膜分成48个网格，然后用数字标记。

2.用2毫升PBS（pH 7.4）将肽稀释至5微克/毫升。将2微升稀释液缓慢滴至格栅中心。添加样本顺序：上行为NP pep，下行为P-pep。每个抗原应加载两个网格。放置30分钟晾干。

3.根据数量将膜切割为一个带有两个网格的单元。在室温下，将膜在封闭缓冲液（TBST（m/v）中的5%脱脂乳）中培养1小时。

抗体稀释

1.用封闭缓冲液将抗体稀释至0.5微克/毫升。

孵化一抗

1.室温下将封闭膜放入稀释的抗体溶液中1小时。

孵化二级抗体

1.（HRP标记的山羊抗兔Ig抗体）

2.用TBST（pH 7.4）清洗膜3-5分钟。

3.用封闭缓冲液稀释二级抗体。

4.二抗在室温下孵育1小时。

着色和显影

1.用TBST（pH 7.4）清洗膜3-5min。

2.将膜放入HRP溶液的基质中着色7分钟。

3.开发。