背景

在监测细胞外抗原时，使用单克隆抗体对细胞进行染色广泛用于表征细胞表面抗原。流式细胞术数据已用于根据表面抗原识别细胞类型家族，并根据对这些抗原的识别对抗体进行分组。流式细胞术用于细胞外染色继续为识别和分离特定细胞群提供有用的数据。该方法需要专用设备，其中可以根据特定荧光共轭物的预期发射波长的存在或不存在来分离细胞混合物。

荧光染料的常见示例：峰值波长（nm）

细胞外抗原的流式细胞术协议

注：荧光试剂应避光。

材料和设备

• 样本单元格

• 12 x 75mm试管

• PBS，0.1%叠氮化钠，1%FBS

• 荧光标记抗体

• 离心机

• 漩涡混合器

• 流式细胞仪

• PBS，0.5%多聚甲醛，4°C

• 微量加样器

• 4°C下PBS/叠氮化钠

程序

1.根据适当的方案制备所需的生物细胞。将细胞浓度调整为每毫升2x10e7个细胞（或每50ul 1x10e6个细胞：每个试验由1x10e6个细胞组成），必要时用PBS、0.1%叠氮化钠、1%FBS或BSA稀释。只要将细胞放在冰上，在染色前可以将其分离长达4小时。注：在某些情况下，可能需要使用非特异性结合剂或阻断剂。如果是这样，添加阻断剂（如正常血清或BSA），并在向细胞中添加抗体之前在RT下培养10分钟。

2.根据所做染色的特定推荐稀释度，适当稀释荧光共轭抗体。使用PBS、0.1%叠氮化钠、1%FBS进行稀释。稀释抗体，以便将10-20ul的体积添加到细胞中。

3.将带有抗体的细胞在4°C的温度下在黑暗中培养30分钟。此时可同时添加用于双重或三重染色的所有共轭抗体（FITC、R-PE等），无需额外培养。

4.孵育后，用1ml PBS、0.1%叠氮化钠、1%FBS洗涤，从细胞中去除未结合抗体。用移液管将PBS、0.1%叠氮化钠、1%FBS移入每根管中，旋涡，然后在4°C下以350xg离心5-7分钟。小心地吸取上清液，在每根管的底部留下约50-100ul。重复此过程，共洗3次。

5.如果当天进行流式细胞术，在吸取上清液后，将细胞重新悬浮在0.5ml冷PBS、0.1%叠氮化钠和1%FBS中。轻轻旋转并分析细胞。如果不在同一天进行分析，则可将细胞固定在0.5ml含0.5%多聚甲醛的冷PBS中，并在2-8°C的黑暗条件下，在含有0.1%叠氮化钠的缓冲液中储存长达48小时。

流式细胞术检测细胞内抗原

细胞固定和渗透

注：除非另有规定，电池应放在冰上

1.用冷PBS清洗电池两次。

2.用2%多聚甲醛将电池固定在冷PBS中15分钟（4°C）。确保细胞在固定过程中均匀再悬浮非常重要。

3.用冷PBS清洗电池两次。

4.在电池缓慢旋转的同时，滴加100%冰冷甲醇使电池渗透。同样，细胞均匀悬浮至关重要。让电池在冷甲醇中浸泡15分钟。（替代渗透方法包括使用0.1%皂甙或0.1%吐温-20。）

5.用冷PBS清洗电池两次。

抗体培养

注：单克隆抗体使用同型匹配对照，多克隆抗体使用物种匹配IgG。使用血细胞仪或其他方法计数细胞。

1.将大约1x10e6细胞添加到每个流式细胞仪管中，并用1 ml 0.1%皂甙或在添加2%FBS的PBS中稀释的吐温20洗涤。

2.将细胞重新悬浮在1 ml 0.1%皂甙（或吐温20）+2%FBS中，并在RT下培养30分钟。该步骤的目的是阻断非特异性结合。

3.在100微升上述封闭溶液中加入20微升稀释至推荐浓度的抗体，并在室温下培养20分钟。

4.如果一级抗体未与荧光色素结合，则需要与荧光色素结合的二级抗体进行第二次孵育。在室温下，在封闭溶液中培养20分钟。

5.用封闭缓冲液清洗细胞一次，最后用PBS清洗

6.将细胞重新悬浮在500ul PBS中，并在流式细胞仪上运行。