概述 

          BroadPharm Dye 马来酰亚胺抗体标记试剂盒含有磺化马来酰亚胺染料，可标记包括抗体在内的含硫醇蛋白质。该试剂盒提供用于标记抗体的优化试剂，每个抗体有 2.5-3 个标记，还提供用于纯化标记分子的脱盐柱。染料马来酰亚胺是一种可控过量成分，可在中性 pH 下与还原抗体的硫醇基团发生反应。抗体的纯化是通过使用离心浓缩器或 SEC 柱进行尺寸过滤实现的。

          100 μg 试剂盒提供的染料足以在约 100 μl 容量中标记 50-200 μg 抗体，而 1 mg 试剂盒可在约 500 μl 容量中标记 1-5 mg 抗体。

概览

实验步骤

          - 准备标记用抗体。
          - 可选： 用 TCEP 还原二硫键（约 30 分钟）。
          - 准备染料储备液。
          - 进行标记反应（2 小时）。
          - 纯化共轭抗体。
          - 计算标记程度。
          - 在共轭抗体中加入抗体稳定剂。

注：收到后，NHS 组份储存在 -20°C 下，B 组份储存在 40C 下。使用前，让所有成分达到室温，开瓶前短暂离心，开始连接前立即配制所需的溶液。以下 SOP 是标记山羊抗小鼠 IgG 抗体的示例。

制备抗体工作溶液 

          1. 制备抗体工作溶液中的抗体：抗体浓度最好为 2 毫克/毫升，置于提供的缓冲液 B 组份或 pH 值为 7.2-7.4 的 PBS 缓冲液中。

          2. 可选项：用 TCEP 还原抗体

          a. 将抗体溶解在 1X PBS 中，浓度约为 2 毫克/毫升。

          加入 ~10 倍摩尔过量的 TCEP。

          b. 将反应溶液培养约 30 分钟。还原反应和随后的标记反应最好在惰性气体（N2 或 Ar）存在下进行，以防止二硫键的重新形成。

注：

          - TCEP 和其他还原剂（如 DTT）会与马来酰亚胺分子发生交叉反应，需要在标记前去除（如通过透析或旋转过滤）。残留的 TCEP 会降低标记效率。

          - 必要时将反应缓冲液中的抗体浓度调整为 2 毫克/毫升。即 100μg 试剂盒在 100μl 反应缓冲液中加入 200μg 抗体，500μl 反应缓冲液中加入 1mg 抗体。

          - 抗体应溶解在所提供的 B 组份缓冲液或 pH7.2-7.4 的 1 倍磷酸盐缓冲液（PBS）中。如果抗体溶解在甘氨酸缓冲液中，则必须用 1 倍磷酸盐缓冲液透析，或使用 Amicon Ultra-0.5，10 kDa 分子量截止值（MWCO）进行脱盐（Millipore Sigma 公司产品编号 UFC501008）。这些方法也可用于去除抗体沉淀中广泛使用的游离胺或铵盐（如硫酸铵和醋酸铵）。

          - 不纯的抗体或用牛血清白蛋白（BSA）或明胶稳定的抗体不能很好地标记。

          - 标记效率随抗体浓度而变化。为获得最佳标记效率，建议最终抗体浓度范围为 1-10 mg/ml。一般来说，抗体浓度越高，染料的标记效率越高。本方案可在抗体浓度为 1-2 mg/ml 时获得最佳标记效果。

实验方案样本

          1. 对于 100 μg 试剂盒，在提供的缓冲液 B 组份或 pH 值为 7.2-7.4 的 PBS 缓冲液中制备浓度为 2 mg/ml 的抗体储备液。取 100 μl 加入小瓶中备用。

          对于 1 毫克试剂盒，根据反应体积 ~500 μl 的期望浓度调整抗体含量。

          2. 计算活性染料储备溶液的适当体积。

          注：对于抗体 lgG（150KDa），建议染料与抗体的摩尔比为 10 比 20。

          其中：

          质量：抗体质量（微克）

          MW：抗体分子量

          MR：是染料与抗体的比率，从 10 到 20。

          Conc.：下面制备的活性染料储备溶液的浓度（nmol/μl）。注：100 μg 试剂盒为 2 nmol/μl；1mg 试剂盒为 10 nmol/μl。
          3. 将一小瓶染料马来酰亚胺瓶加热至室温，然后加入 50 μl 无水二甲基亚砜。100 μg 试剂盒的活性染料储备液浓度为 2 nmol/μl；1mg 试剂盒的活性染料储备液浓度为 10nmol/μl。

          4. 根据公式 1 向抗体缓冲液瓶中加入适量的活性染料溶液，混匀。用铝箔纸包裹小瓶，防止抗体/染料溶液受光，室温下轻轻摇晃孵育 1 小时。

          5. 对于大多数生物应用，这里列出了每种染料的最佳 DOL 供参考。

注意：DOL 取决于抗体浓度、活性染料/抗体比例和抗体中游离 -SH 的含量。如果需要更高的 DOL，请使用表格优化标记条件（MR）和还原条件（TCEP/DTT 用量和孵育时间）。

缓冲液交换和去除过量染料 

          100 μg 试剂盒，通过旋柱去除过量染料： 

          1. 取下 Zeba Spin 脱盐柱的底部封盖，然后松开但不要取下盖子。

          2. 将色谱柱放入 1.5-2.0 毫升的收集管（微离心管）中。以 1,500 × g 离心 1 分钟，除去储存液。

          3. 在柱子上压实的树脂向上倾斜的一侧做一个标记。在随后的离心步骤中，将柱放入微离心机中，标记朝外。

          4. 将色谱柱转移到一个新的收集管中，打开盖子，将标记反应样品缓慢地涂抹到密实 树脂床的顶部（体积不超过 130 μl）。

          5. 以 1 500 × g 离心 2 分钟，收集样品。使用后丢弃脱盐柱。

          6. 染料抗体在 4°C 下储存 < 1 个月。如需长期保存，请在 -20°C 或 -80°C 下保存，可选择使用稳定剂（如 0.1% 牛血清白蛋白）和 0.02-0.05% 叠氮化钠。

通过蛋白质浓缩器去除 1 毫克试剂盒中的过量染料： 

          1. 用 400 至 500 μl 反应缓冲液或去离子水将浓缩器膜 “过滤装置 ”水合，然后进行 14,000 x g 微速离心 3 分钟。丢弃过滤装置和收集管中的液体。

          2. 向浓缩器/过滤装置中加入 500 μl 的染料抗体进行离心。微速离心 14,000 x g，8 分钟，或离心至过滤装置中剩余的最小体积 ~ 50 μl。丢弃收集管中的废液。

          3. 向过滤装置中加入反应缓冲液进行脱盐，总体积不超过 500 μl；通常为 ~450 μl 缓冲液。14,000×g 微速离心 8 分钟，或离心至过滤装置中剩余的最小体积 ~50 μl。丢弃收集管中的废液。

          4. 重复步骤 3 两次。

          5. 将过滤装置中的染料抗体收集到微离心管中。

          6. 为达到最大回收率，可选择在过滤装置中加入少量缓冲液 B 组份（由用户决定），以冲洗掉残留的抗体，微离心脉冲旋转，从过滤装置中收集抗体/反应缓冲液，加入步骤 5 的微离心管中，混匀。

染料/蛋白质比率计算

          要计算染料与抗体的比率，可测量共轭物的吸收光谱，或 280 纳米波长处的吸收（AAb）和染料吸收最大值处的吸收（Adye）。染料标记抗体的典型吸收光谱如下所示。根据染料的不同，最大值的波长也可能不同。

A ᵈʸᵉ : 染料的吸光率

Ɛ ᵃᵇ : 生物分子在 280 纳米波长处的摩尔消光系数

A ᵃᵇ : 染料-蛋白质共轭物在 280 纳米波长处的吸光率

CF: 280nm 处的修正系数，用于计算染料在 280nm 处的吸收情况

Ɛ ᵈʸᵉ : 染料的摩尔消光系数

存储抗体染料

          抗体共轭物应在有载体蛋白存在的情况下保存。

故障排除

FAQ:

          Q: 硫醇-马来酰亚胺反应的机理是什么？

          A:

          图 3 显示了硫醇-马来酰亚胺反应的一般机理。烯烃的高特异性反应活性主要是由于 (a) 键角变形产生的环应变和 (b) 羰基的顺式构象定位。在水、二甲基亚砜 (DMSO)、N,N'-二甲基甲酰胺 (DMF) 或 N,N'-二甲基乙酰胺 (DMAC) 等高极性溶剂中，硫醇马来酰亚胺反应无需催化剂即可进行，因为活性物种硫酸根离子已经形成。

         Q:该反应的正确 pH 值是多少？

         A:pH 值 6.5 到 pH 值 7.5，硫醇-马来酰亚胺反应对硫醇具有化学选择性。在 pH 值为 7.0 时，马来酰亚胺与硫醇的反应速率比马来酰亚胺与胺的反应速率快约 1000 倍。然而，当 pH 值超过 7.5 时，游离伯胺会在马来酰亚胺 C=C 键处与硫醇发生竞争性反应。 

         Q:硫代琥珀酰亚胺共轭物是否稳定？

         A:在水溶液中，马来酰亚胺环可通过水解作用打开。这种水解敏感性随着 pH 值的升高而增加。重要的是，如果开环反应发生在硫醇化之前，则生成的马来酰亚胺对硫醇没有反应。另一方面，如果硫代反应已经发生，开环的琥珀酸硫醚就会变得稳定。由于开环水解和失活的倾向，我们不建议对含有马来酰亚胺的产品进行水溶液储存，因为马来酰亚胺是用于未来反应的。如果需要储存溶液，请使用干燥、与水混溶、生物相容性好的溶剂，如 DMSO、DMF 或 DMAC）。

          染料马来酰亚胺产品易于按照我们在产品信息表中推荐的说明有效使用。

          以下是使用我们的染料马来酰亚胺产品时推荐的一些最佳做法。

          - 除使用外，产品应在建议的温度下储存。几乎所有含有马来酰亚胺的产品的建议储存温度都是 -20°C。

          - 当含有马来酰亚胺的产品从仓库中取出时，应使其完全平衡至环境温度，然后再打开存放产品的瓶子或小瓶。

          - 含马来酰亚胺产品的水溶液应在使用前立即配制。如果马来酰亚胺官能团要进行反应，pH 值应在 6.5 - 7.5 之间，最好在此范围内尽可能低。

          - 含马来酰亚胺产品的水缓冲液和有机溶液应不含伯胺和仲胺，也不含硫醇。如果需要在与含马来酰亚胺产品的反应中使用碱，我们建议使用高度受阻的有机碱，如 2,6-丁脒（CAS 编号 108-48-5；EC 编号 203-587-3）。

         - 由于存在水解风险，请勿将含马来酰亚胺的产品储存在水溶液中。相反，应使用干燥的、生物相容性好的水溶性溶剂（如 DMSO、DMF 或 DMAC）来长期储存这些化合物。这些溶剂可在 20 - 25°C 的温度下，在 3 Å 分子筛（建议 8×12 目）上干燥 24 - 48 小时。溶解后的含马来酰亚胺产品应储存在 -20°C 下。我们没有关于含马来酰亚胺的产品在溶液中储存的稳定性的信息，因为我们明确不建议将这些产品储存在溶液中。

          - 将含马来酰亚胺的产品与蛋白质共轭时，如果在反应混合物中加入有机溶剂中含马来酰亚胺产品的储备溶液（见上文），则有机溶剂不应超过最终反应体积的 10%，其余体积应为水或水性缓冲液（如 PBS）。某些敏感蛋白可能要求有机溶剂的用量远低于最终反应体积的 10%。

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