概述

         Broadpharm 抗体共轭试剂盒含有最流行的磺化活性染料，最适合标记抗体和其他敏感蛋白。该试剂盒提供用于标记抗体的优化试剂，每个抗体可标记 2.5-3 个标签，还提供用于纯化标记分子的脱盐柱。在反应中，染料 NHS 酯是受控的过量反应成分。它在弱碱性 pH 下与抗体赖氨酸的胺基发生反应。抗体的纯化是通过使用离心浓缩器进行尺寸排阻过滤实现的。100 μg 试剂盒可在约 100 μl 容量中标记 50-200 μg 抗体，1 mg 试剂盒可在约 500 μl 容量中标记 1-5 mg 抗体。

         注：不建议用该试剂盒标记 IgM 抗体，因为 IgM 在碱性反应条件下可能会变性。该试剂盒也可用于标记非免疫球蛋白。对于不同的蛋白质，染料储备液与蛋白质量的比例可能需要优化。根据蛋白质分子量的不同，染料去除方法可能需要调整。要通过超滤去除游离染料，蛋白质应比超滤膜的截留分子量（MWCO）至少大 3 倍。对于分子量为 10-30 kDa 的蛋白质的超滤，建议使用截留分子量为 3 kDa 的超滤瓶。

          注：收到后，将成分 NHS 存放在 -20°C 下，将反应缓冲液存放在 4°C 下。让所有成分达到室温，开瓶前短暂离心，开始连接前立即配制所需的溶液。以下 SOP 是标记山羊抗小鼠 IgG 抗体的示例。

配制工作溶液

          1. 抗体工作溶液：在所提供的反应缓冲液成分中，抗体浓度最好为 2 毫克/毫升。

          注： 

          - BP Fluor 488 和荧光素的反应缓冲液为 1M NaHCO3，pH 8.5。其他染料的反应缓冲液为 10mM PBS，pH 7.4。

          - 必要时将反应缓冲液中的抗体浓度调整为 2 mg/ml。即 100 微克试剂盒在 100 微升反应缓冲液中加入 200 微克抗体。对于 1 毫克试剂盒，可根据标记反应体积（最大约 500 微升）所需浓度调整含量。

          - 应将抗体溶解在提供的缓冲液 B 组份中进行标记反应。

          如果抗体溶解在甘氨酸缓冲液中，则必须用 1X PBS 或 1M NaHCO3 进行透析，或使用 Amicon Ultra-0.5，10 kDa 分子量截止值（MWCO）（密理博公司的 Cat # UFC501008），以去除抗体沉淀中广泛使用的游离胺或铵盐（如硫酸铵和醋酸铵）。

          - 不纯的抗体或用牛血清白蛋白（BSA）或明胶稳定的抗体不能很好地标记。

          - 标记效率随抗体浓度和染料 NHS/蛋白质摩尔混合比（MR）而变化。为获得最佳标记效率，建议最终抗体浓度范围为 1-10 mg/ml。            一般来说，抗体浓度和 MR 越高，染料的标记效率就越高。

          - 注：对于抗体 lgG（150KDa），MR 是建议的染料与抗体摩尔比。

表 1： 染料 NHS 的建议混合比 (MR)：抗体摩尔比。

对于大多数生物应用，这里列出了共轭物的最佳 DOL 供参考。

2. 计算活性染料储备溶液的适当体积。

其中

质量：抗体质量（微克） 

MW：抗体分子量 

MR：表中的活性染料：抗体比率

Conc：下面制备的活性染料储备溶液的浓度（纳摩尔/微升）。

注：100 微克试剂盒为 2 毫微摩尔/微升；1 毫克试剂盒为 10 毫微摩尔/微升

样本实验方案

          1. 对于 100 μg 试剂盒，在提供的缓冲液 B 组份中制备浓度为 2 mg/ml 的抗体储备液。(用旋转柱去除标记后的染料，最大处理量为 130 μl）。

          对于 1 毫克试剂盒，根据所提供的缓冲液 B 组份中的抗体浓度进行调整。

          2. 让一小瓶染料 NHS 升温至室温，然后加入 50 µl 无水二甲基亚砜。涡旋使染料溶解。100ug 试剂盒的活性染料储备液浓度为 2 nmol/µl；1mg 试剂盒的活性染料储备液浓度为 10 nmol/µl。

          3. 根据公式 1 向抗体缓冲液瓶中加入适量的活性染料溶液，混匀。用铝箔纸包裹小瓶，防止抗体/染料溶液受光，室温下轻轻摇晃孵育 1 小时。

缓冲液交换和过量染料去除

100 μg 试剂盒，通过旋柱去除过量染料：

          1. 取下 Zeba Spin 脱盐柱的底部封盖，然后松开但不要取下盖子。

          2. 将色谱柱放入 1.5-2.0 毫升的收集管（微离心管）中。以 1,500 × g 离心 1 分钟，除去储存液。

          3. 在柱子上压实的树脂向上倾斜的一侧做一个标记。在随后的离心步骤中，将柱放入微离心机中，标记朝外。

          4. 将色谱柱转移到一个新的收集管中，打开盖子，将标记反应样品缓慢地涂抹到密实 树脂床的顶部（体积不超过 130 μl）。

          5. 以 1 500 × g 离心 2 分钟，收集样品。使用后丢弃脱盐柱。

          6. 染料抗体在 4°C 下储存 < 1 个月。如需长期保存，请在 -20°C 或 -80°C 下保存，可选择使用稳定剂（如 0.1% 牛血清白蛋白）和 0.02-0.05% 叠氮化钠。

通过蛋白质浓缩器去除 1 毫克试剂盒中的过量染料：

          1. 用 400 至 500 μl 反应缓冲液或去离子水将浓缩器膜 “过滤装置 ”水合，然后进行 14,000 x g 微速离心 3 分钟。丢弃过滤装置和收集管中的液体。

          2. 向浓缩器/过滤装置中加入 500 μl 的染料抗体进行离心。微速离心 14,000 x g，8 分钟，或离心至过滤装置中剩余的最小体积 ~ 50 μl。丢弃收集管中的废液。

          3. 向过滤装置中加入反应缓冲液进行脱盐，总体积不超过 500 μl；通常为 ~450 μl。微速离心 14000 x g，8 分钟，或离心至过滤装置中剩余的最小体积 ~ 50 μl。丢弃收集管中的废液。

          4. 重复步骤 3 两次。

          5. 将过滤装置中的染料抗体收集到微离心管中。

          6. 为达到最大回收率，可选择在过滤装置中加入少量缓冲液 B 组份（由用户决定），以冲洗掉残留的抗体，微离心脉冲旋转，从过滤装置中收集抗体/反应缓冲液，加入步骤 5 的微离心管中，混匀。

染料/蛋白质配比计算

          要计算染料与抗体的比率，可测量共轭物的吸收光谱，或 280 纳米波长处的吸收（AAb）和染料吸收最大值处的吸收（Adye）。染料标记抗体的典型吸收光谱如下所示。根据染料的不同，最大值的波长也可能不同。

A ᵈʸᵉ : 染料的吸光率

Ɛ ᵃᵇ : 生物分子在 280 纳米波长处的摩尔消光系数

A ᵃᵇ : 染料-蛋白质共轭物在 280 纳米波长处的吸光率

CF: 280nm 处的修正系数，用于计算染料在 280nm 处的吸收情况

Ɛ ᵈʸᵉ : 染料的摩尔消光系数

抗体染料的储存

抗体共轭物应在有载体蛋白存在的情况下保存

排错

FAQ

Q:优化后的 D/P 比率是多少？

A:这取决于染料和应用。例如，对于 800 CW，IgG 抗体的 D/P 比为 1:1 - 2:1，适合 Western 和 In-Cell Western 应用。对于 IgG 抗体，较高的 D/P 比（3:1 - 4:1）仍可用于 Western 印迹检测，但可能会增加背景，因此在其他应用中的表现并不理想，但对于 BP Fluor 488 和荧光素，大多数应用都需要 D/P 4-9。

对于体内成像应用，共轭物的染料/蛋白质比率可能会影响蛋白质的生物或生化活性、信噪比、血液清除率和生物分布。

Q: 我可以用这些染料 NHS 标记试剂盒标记其他蛋白质吗？

A: 可以。请查看下面的 BP Fluor 647 参考表；对于其他染料，请相应使用此表。

表 1. 推荐的 BP Fluor 647 染料 NHS 与蛋白质摩尔比 (MR)、10mM PBS pH 7.4 和标记 12-150 kDa 蛋白质的典型产量

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阿拉丁官网：https://www.aladdin-e.com