背景

免疫细胞化学是一种与免疫组织化学非常相似的免疫技术。免疫细胞化学用于观察细胞（培养细胞、细胞悬液）而不是组织中特定蛋白质或抗原的存在。可以研究的细胞样本类型包括血液涂片、培养细胞、细胞悬浮液和细胞纺锤体。每种类型的细胞样本的制备和处理略有不同，但免疫细胞化学和免疫组织化学之间一级抗体、二级抗体和显色的基本用途非常相似。

对于免疫细胞化学，样品制备涉及将靶细胞固定在载玻片上。细胞可以通过几种方法附着在固体表面：粘附细胞可以在显微镜载玻片上生长；细胞悬浮液可以离心到载玻片上（cytospin），或使用化学连接剂结合到固体载体上。

为了确保抗体接近其抗原，细胞必须固定和渗透。在理想情况下，固定将固定抗原，同时保留天然细胞结构，并允许抗体不受阻碍地进入所有细胞和亚细胞室。

固定方法通常分为两类：有机溶剂和交联试剂。有机溶剂，如醇和丙酮，可以去除脂质并使细胞脱水，同时使蛋白质沉淀在细胞结构上。交联试剂（如多聚甲醛）通常通过游离氨基形成分子间桥，从而形成连接抗原的网络。交联剂比有机溶剂更好地保持细胞结构，但可能会改变某些细胞成分的结构，以至于不能被一级抗体识别。

固定方法

1.丙酮固定-20°C丙酮中固定细胞5-10分钟。丙酮固定后无需渗透步骤。

2.甲醇固定将电池固定在-20°C甲醇中5-10分钟。甲醇固定后无需渗透步骤。

3.乙醇固定将细胞固定在冷却的95%乙醇、5%冰乙酸中5-10分钟。

4.甲醇-丙酮固定将电池固定在冷却的甲醇中，在-20°C下10分钟。去除多余的甲醇。在-20°C下用冷却的丙酮渗透1分钟。

5.甲醇-丙酮固定制备1:1甲醇和丙酮混合物，并在-20°C下将细胞固定5-10分钟。

6.甲醇-乙醇固定制备1:1甲醇和乙醇混合物，并在-20°C下将电池固定5-10分钟。

7.福尔马林固定将细胞固定在10%中性缓冲福尔马林中5-10分钟。用PBS短暂冲洗。用0.5%Triton X-100渗透10分钟。

8.多聚甲醛-Triton固定将细胞固定在3-4%多聚甲醛中10-20分钟。用PBS短暂冲洗。用0.5%Triton X-100渗透10分钟。

9.多聚甲醛-甲醇固定将细胞固定在4%多聚甲醛中10-20分钟。用PBS短暂冲洗。在-20°C下用冷却的甲醇渗透5-10分钟。

渗透方法

交联剂通常需要添加渗透步骤，以允许抗体进入样本。两组化合物可用于渗透：有机溶剂和温和的表面活性剂。醇和丙酮可作为一步固定/渗透方法。这些溶剂除了具有固定作用，可在适当位置沉淀蛋白质外，还可溶解膜脂，使膜对抗体具有渗透性。在表面活性剂类别中，皂甙、Triton X-100、Tween-20等可用于破坏膜。

免疫细胞化学（HRP检测）

所需材料

• 去离子水

• 美国公共广播电视公司

• Triton®声波风廓线仪X-100

• 过氧化氢（H2O2）

• 一级抗体

• 生物素化二级抗体（或HRP结合二级抗体）

• 牛血清白蛋白（BSA）

• 链霉亲和素

• 轻而快地擦掉

• 甘油

• 苏木精（可选）

• 乙酸（可选）

样品制备

1.将细胞培养物转移到一个或多个载玻片的孔中。加入新鲜培养基，使细胞生长融合。

2.在PBS中彻底清洗电池5x2分钟。

固定步骤

3.用合适的固定方法固定细胞（见上文）。

4.在PBS中冲洗5x2分钟。

渗透步骤

5.将载玻片与0.25-0.5%Triton X-100（或其他渗透介质）在PBS中培养10分钟，使膜渗透（注：丙酮或甲醇固定后无需渗透步骤）。

6.在PBS中漂洗3x5分钟。

内源过氧化物酶阻断步骤

7.在PBS中的3%H2O2中培养10-30分钟，阻断内源性过氧化物酶（仅当使用HRP结合的二级抗体时才需要此步骤）

8.在PBS中冲洗3x5min。

阻断非特异性结合

9.在PBS中用2-5%的正常血清阻断1小时。正常血清应与产生二级抗体的物种相同。（或者，5%牛血清白蛋白有时用作阻断剂。）

一级抗体培养

10.在1%正常血清PBS中将一抗稀释至推荐浓度。

11.从滑梯上取下挡块缓冲垫。

12.在每个孔中加入一级抗体。在室温下培养1-2小时或在4°C下培养过夜。

13.取出一级抗体溶液，在PBS中冲洗载玻片3 x 5分钟。

二级抗体培养

14.在1%BSA稀释剂中稀释生物素化二级抗体。

15.从载玻片中取出多余的液体，并向每个孔中添加二级抗体溶液。在室温下培养1小时。

16.在PBS中漂洗3 x 5分钟。清除多余的液体。

颜色显影

17.将链霉亲和素HRP添加到每个孔中。在室温下培养30分钟。

18.在轨道振动筛上用PBS洗涤3 x 5分钟。清除多余的液体。

19.将DAB溶液加入每个电池中。一旦细胞开始变成棕色（可以在显微镜下观察到），在摇床上的PBS中洗涤2 x 5分钟。

可选反染色

20.将载玻片浸入苏木精染色皿中30秒。

21.取出并放入酸浴中（200ml dH2O和1-3滴乙酸）。用dH2O冲洗。

盖滑动

22.在载玻片上添加盖玻片，以便在显微镜下检查