背景

免疫组织化学广泛用于基础研究，以了解生物标记物和差异表达蛋白在生物组织不同部位的分布和定位。IHC染色也广泛用于诊断异常细胞，如癌症肿瘤中发现的细胞。抗体-抗原相互作用的可视化可以通过多种方式实现。在最常见的情况下，抗体与酶或辅助因子结合，例如生物素、辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP），它们可以催化产生颜色的反应。或者，抗体也可以标记到荧光团。例如荧光素（FITC）或R-藻红蛋白（PE）（见免疫荧光）。

通过使用共轭一级抗体，可以进行直接IHC，但由于使用共轭二级抗体可以产生放大效应，因此很少使用这种方法。免疫组织化学二级抗体的选择与ELISA和Western Blot相似。共轭二级抗体专门针对一级抗体的宿主物种及其特定的同种型（例如，小鼠IgG1、山羊IgM、兔IgG1、k、鸡IgY等）。此外，如果使用具有Fc受体的组织或细胞（胸腺、脾脏、血液、造血细胞、白细胞、B细胞等），最好选择F（ab’）2片段，以消除通过细胞上存在的Fc受体的非特异性结合。作为替代方法，可通过在来自二级抗体宿主物种的纯化正常血清中培养细胞来阻断IgG全分子二级抗体与Fc受体的结合。

免疫组织化学（新鲜冰冻切片）

所需材料

• 丙酮

• 组织学级无水变性乙醇（100%和95%）

• 二氧化二氢

• 血毒素

• 二甲苯

• 10X TBS：制备1升10X TBS:24.2g Tris碱，80g氯化钠；用HCl将pH值调节至7.6（在1X下使用）。

• 洗涤缓冲液TBS/T:1X TBS，0.1%吐温-20：为制备1升，向900ml ddH2O中添加100ml 10x TBS。加入1ml吐温20并混合。

• 10mM柠檬酸钠缓冲液：为制备1升，向1升dH2O中添加2.94g柠檬酸钠。将pH值调节至6.0。

• 3%过氧化氢：制备时，向90ml dH2O中添加10ml 30%H2O2。

• 封闭溶液：TBS中5%的马血清或山羊血清

• ABC试剂：使用前30分钟根据制造商的说明进行准备。

• DAB试剂：根据制造商的建议制备。

组织准备：

1.在液氮中快速冷冻小组织块（5x5x3mm）。

2.转移至低温恒温器，切成薄片（5-30um），并将切片转移至带正电的载玻片（聚赖氨酸涂层）。

3.在室温下干燥载玻片（如果当天进行染色，则1-2小时直至完全干燥）。注意：需要彻底干燥才能正确粘附在载玻片上。

固定方法

4.固定方法多种多样。遵循产品数据表中提到的特定方法，或为您的样品找到合适方法。

• 冷丙酮：在-20°C下10分钟。风干

• 甲醇：在-20°C下10分钟

• 10%中性缓冲福尔马林：室温下10分钟

• 3%甲醛：室温下15分钟

• 3%甲醛/甲醇：室温下15分钟，然后在-20°C的甲醇中5分钟（中间不要冲洗）

5.将载玻片在pH 7.4（含1%吐温20）的PBS中洗涤3次，每次5分钟。

固定、冷冻组织切片

1.用固定剂灌注组织或将组织浸泡在固定剂中一段时间。4%多聚甲醛是最常用的固定剂。

2.将组织浸入PBS中含有10-30%蔗糖的细胞保护剂溶液中。当组织不再漂浮在溶液中时，冷冻保护完成。

3.从细胞保护剂溶液中取出组织，并在-70°C下保存，直至切片。

4.从-70°C冷冻柜中取出组织，并在-20°C下平衡约15分钟，然后尝试切片。平衡有助于防止分段时砌块开裂。

5.使用低温恒温器，制备可直接收集到载玻片上的10-15um切片。通常每个幻灯片可以放置3个部分；相隔很远。

6.彻底干燥载玻片上的切片。干燥可以通过空气干燥或使用滑动加热器来完成，通常是隔夜，或在40-50°C下至少2-3小时。

7.制备的载玻片可在-70°C下干燥保存，直至染色。在复水和染色之前，平衡至室温并短暂重新干燥。

石蜡包埋切片

1.脱蜡和水合段

• 二甲苯2-3次变化，每次5分钟

• 100%无水乙醇：2次更换，每次3分钟

• 95%乙醇：2次更换，每次3分钟

• 80%乙醇：3分钟

• 50%乙醇：3分钟

• 蒸馏水、PBS或Tris缓冲液：2次更换，每次3分钟。

注意：一旦组织切片被重新水化，就不要让它们干燥。用吸水布擦干纸巾部分周围的载玻片。使用钻石铅笔、中国记号笔或指甲油，在显微镜载玻片上围绕切片画一个圈。在随后的试剂培养过程中，该圆圈将有助于将溶液保留在切片上。

2.必要时进行抗原回收。（有关抗原提取方法，请参阅第五节。使用柠檬酸缓冲液的HIER（热诱导表位提取）是一种常用方法。

3.在室温下将载玻片浸入0.3-3%过氧化氢和100%甲醇中10-30分钟，阻断内源性过氧化物酶（如需要）。

4.在蒸馏水中清洗切片，每次更换2次，每次5分钟。

免疫染色

阻断

1.将切片与来自与二级抗体相同物种的3-10%正常血清孵育30分钟，以阻断免疫球蛋白的非特异性结合。

2.去除堵塞液。

一级抗体培养

（所有步骤均应在潮湿环境中进行。）

3.在封闭溶液中稀释一抗。如果不建议稀释，则在1:10、1:100和1:1000时开始测试。

4.在4°C下培养过夜。

5.去除抗体溶液。在pH值为7.4的PBS中洗涤3 x 5分钟。

6.如果一抗是HRP结合的，则进行显色。

二级抗体培养

7.根据推荐稀释度在封闭溶液中稀释生物素结合二抗。在室温下培养30-60分钟。

8.去除二级抗体溶液。在洗涤缓冲液中洗涤载玻片3 x 5分钟。

颜色显影

9.将链霉亲和素-辣根过氧化物酶试剂添加到每个切片中，并在室温下培养30分钟。

10.去除ABC试剂。在洗涤缓冲液中洗涤3段，每次5分钟。

11.涂抹DAB溶液，在潮湿环境中完全覆盖各部分。在室温下培养5-15分钟。或者，在显微镜下观察载玻片，以确定不溶性沉淀物的颜色强度。

12.一旦变色，用dH2O轻轻冲洗以停止反应。

13.根据需要用苏木精和曙红复染组织，以确定抗原接近正常预期结构。

14.用dH2O清洗载玻片。

脱水和盖玻片应用

15.使用一系列甲醇或乙醇分级浓度：50%（2x5min）、75%（2x5min）和100%（2x5min）对样品进行脱水储存。

16.在二甲苯中重复上述步骤，将切片培养两次，每次10秒。

17.让载玻片风干。

18.安装盖玻片

抗原回收

通过抗原回收方法的预处理可以显著改善许多抗原的可视化，这些方法可以破坏福尔马林固定形成的蛋白质交联，从而发现隐藏的抗原位点。抗原回收技术通常涉及加热不同时间或使用蛋白酶（如蛋白酶K、胰蛋白酶或胃蛋白酶）进行酶消化。

加热方法通常使用微波炉、高压锅、蒸锅或水浴。样品在接近100°C的温度下加热20分钟，然后冷却相当长的时间。最常用的回收溶液是a）柠檬酸缓冲液，pH 6.0，b）Tris-EDTA，pH 9.0和c）EDTA，pH 8.0。

柠檬酸缓冲液抗原回收

柠檬酸缓冲液：10mM柠檬酸钠，0.05%吐温-20，pH 6.0或10mM柠檬酸，0.05%吐温-20，pH 6.0

1.用含有柠檬酸钠缓冲液或柠檬酸盐缓冲液的染色皿预热蒸汽或水浴，直到温度达到95-100℃。

2.将载玻片浸入染色皿中。将盖子松弛地放在染色皿上，培养20-40分钟（合适的培养时间应由用户确定）。

3.关闭蒸锅或水浴，将染色皿移到室温，让载玻片冷却20分钟。

4.在TBS-Tween-20中冲洗切片2x2分钟。

5.转至阻塞步骤。