背景

免疫沉淀是一种能够纯化蛋白质的方法。此外，人们可以使用免疫沉淀来确认感兴趣蛋白质的特性或研究其生化特性、翻译后修饰和表达水平。将感兴趣蛋白质的抗体与细胞提取物一起培养，以便抗体将在溶液中结合蛋白质。然后使用蛋白质A/G偶联琼脂糖珠从样品中提取抗体/抗原复合物。这从物理上将感兴趣的蛋白质与样本的其余部分隔离开来。然后通过SDS-PAGE分离样品，进行蛋白质印迹分析。

免疫沉淀方案

裂解缓冲液

理想的裂解缓冲液将使蛋白质保持其天然构象，最大限度地减少抗体结合位点的变性，同时从样品中释放足够数量的蛋白质用于后续分析。影响IP成功的其他变量包括盐浓度、二价阳离子浓度和pH值。

1.NP-40细胞裂解缓冲液：50mM Tris-HCl pH 8.0，150mM NaCl，1%NP-40

2.蛋白酶抑制剂鸡尾酒（100X）：PMSF，5mg（50ug/ml），抑肽酶，100ug（1μg/ml），亮肽，100ug（1ug/ml），胃蛋白酶抑制剂，100ug（1ug/ml），100%乙醇，最多1ml，等分并保持在-20°C。（使用前加入裂解缓冲液。）

3.RIPA（放射免疫沉淀分析）缓冲液（替代）RIPA缓冲液对于核提取物的核膜破坏特别有用。RIPA缓冲液背景较低，但可以变性激酶。50mM Tris-HCl，pH 8，150 mM NaCl，1%NP-40，0.5%脱氧胆酸钠，0.1%十二烷基硫酸钠（10%脱氧胆酸钠储备溶液（5g/50ml）必须避光。）

裂解物的制备

1.收获约10e7个细胞。注：应针对每种蛋白质和抗体专门优化每毫升细胞总数和每道凝胶加载的细胞当量。

2.在锥形管中用约10 ml PBS清洗细胞，并在400xg下旋转10分钟。丢弃上清液。

3.在锥形管中用约10 ml PBS清洗细胞，并在400xg下旋转10分钟。

4.第二次洗涤后，完全去除上清液，并将细胞颗粒重新悬浮在1ml含1X蛋白酶抑制剂混合物的冷裂解缓冲液中（最终浓度为10e7个细胞/ml）。轻轻地旋转管子。注：为了有效防止蛋白酶作用，应预冷裂解缓冲液，并在4°C下执行以下所有步骤。对于粘附的单层，在每100mm培养皿中添加1ml含有1X蛋白酶抑制剂混合物的冷裂解缓冲液。

5.将试管或盘子放在冰上30分钟，偶尔搅拌。在4°C下，在10000Xg下旋转细胞裂解物15分钟。

6.小心收集上清液，不要干扰颗粒，并转移到干净的管中。此时可将细胞裂解物冷冻，以便在-70°C下长期储存。丢弃颗粒。

预清除裂解物

1.如果使用单克隆抗体，则选择蛋白G偶联琼脂糖珠；如果使用多克隆抗体，蛋白a偶联的琼脂糖珠通常是合适的（参见表1）。

将50ul蛋白质G珠浆转移到eppendorf管中，并添加450ul冷裂解缓冲液。在10000Xg下旋转30秒，并移除裂解缓冲液。

2.用500ul冷裂解缓冲液洗涤一次。将微珠重新放入50ul的冷裂解缓冲液中。

3.将50ul制备的蛋白G浆料和500ul细胞裂解液加入eppendorf管中，在冰上培养30-60分钟。

4.在4°C下以10000Xg旋转10分钟，并将上清液转移到新鲜的eppendorf中。如果转移了任何珠子，再次旋转并小心地将上清液转移到另一个新鲜的eppendorf管中。

免疫沉淀

1.将5-10ug抗体添加到含有冷预澄清裂解物的eppendorf管中。注：建议将此浓度的单克隆抗体作为起点。在4°C下培养1小时。

2.将50ul洗涤后的蛋白G浆料加入预冷冻裂解缓冲液中（按照上述预清洗步骤1的说明制备）。

3.在4°C的摇动平台或旋转器上培养1小时。

4.在4°C下，在10000xG下旋转eppendorf管30秒。

5.小心地完全去除上清液，并用500ul的裂解缓冲液清洗珠子3-5次。为了尽量减少背景，应注意在这些洗涤液中完全去除上清液。

6.最后一次洗涤后，吸取上清液，向小球中加入50ul 1X Laemmli样品缓冲液。

7.涡流并加热至90-100°C，持续10分钟。

8.在10000Xg下旋转5分钟，收集上清液并加载到凝胶上。如果稍后要运行凝胶，可以收集上清液样本并在此时保持冷冻。

表 1：选择正确的磁珠 - 总结