免疫沉淀和SDS-PAGE的联合程序可以成为评估复杂蛋白质混合物中抗体反应性抗原的数量和大小的有力工具。基本方案使用一级抗体和二级抗体琼脂糖结合物来免疫沉淀抗原。

所需试剂

• TBS：使用10XTBS，pH 7.5（1.0M Tris-HCl，1.5M NaCl）。用dH2O将适当体积稀释至1X。在室温下储存一个月。

• 裂解缓冲液：TBS、1.0%的适当洗涤剂（即Triton X-100）、1mg/ml BSA和适当的蛋白酶抑制剂。

• 稀释缓冲液：与不含蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液相同。

• 用于裂解物预处理的琼脂糖结合物。预吸附裂解物以去除与一级和二级抗体的非特异性结合。使用来自同一物种的琼脂糖正常IgG作为一级抗体和宿主二级抗体。使用稀释缓冲液以1:1的比例制备洗涤浆液。

一级抗体

• 一级抗体对照：对于多克隆抗血清，使用来自同一物种的非免疫血清。对于单克隆抗体，使用相同的同型和纯度。

• 用于免疫沉淀的琼脂糖结合物：使用琼脂糖二级抗体结合物对抗与一级抗体相同的物种。使用稀释缓冲液以1:1的比例制备洗涤浆液。

• Tris缓冲液：制备0.05M Tris缓冲液，pH 6.8。

• 2XSDS-PAGE样品缓冲液。

• 2-巯基乙醇

程序

1.将5 x 10e7细胞置于裂解缓冲液中，在冰上培养30至60分钟，制备裂解物。

2.旋涡裂解物并在250 x g下离心10分钟，以去除细胞核。保留上清液。

3.通过在100000 x g下离心30分钟或在10000 x g下微离心30分钟来澄清上清液。

4.通过添加琼脂糖结合物预处理裂解物以去除非特异性蛋白质结合。每200ul裂解液使用10ul对照琼脂糖。在4°C下摇晃1小时。在200 x g下离心。保存上清液。

5.将200ul含抗原的预处理裂解液添加到两个微囊试管中。用稀释缓冲液将体积增至1ml。

6.在一根试管中加入一抗。对于多克隆抗血清或腹水，使用0.5-5.0ul。对于组织培养上清液，使用10-100ul。向第二个试管中加入等量的一级抗体对照品。在冰上孵育1小时。

7.对于免疫沉淀，每管添加50ul琼脂糖结合物。在4°C下轻轻摇晃1小时。

8.200 x g离心管1分钟或微离心5秒。用移液管小心地除去上清液。轻轻地将颗粒重新悬浮在1ml稀释缓冲液中。重复清洗。随后在TBS中清洗，然后在pH值为6.8的0.5M Tris中进行最终清洗。

9.按上述方法再次离心。添加20-50ul样品缓冲液。在100°C下混合并加热5分钟。短暂微量离心，并将上清液直接应用于非还原性SDS-PAGE。如果需要还原条件，将上清液转移到新管中，并添加5%2-巯基乙醇。按上述方法混合并加热。

10.电泳蛋白混合物。染色凝胶或免疫印迹显示。出现的条带包括抗原多肽和使用的抗体。