一、实验原理

（1）骨髓间充质干细胞的获得与富集原理

骨髓组织中含有多种细胞成分，包括造血干细胞、间充质干细胞、单核细胞、淋巴细胞等。通过密度梯度离心，可根据细胞密度差异分离出富含单个核细胞的一层。进一步利用间充质干细胞对塑料表面的贴壁特性，在含血清的培养基中长期贴壁培养并多次换液，可逐渐去除不贴壁或弱贴壁的血源细胞，从而获得相对富集、形态均一的BMSCs。

（2）破骨细胞诱导分化的细胞因子作用机制

在体外条件下，骨髓来源的单个核细胞在M-CSF（macrophage colony-stimulating factor）和RANKL（receptor activator of NF-κB ligand）的共同作用下，可发育为破骨细胞样多核细胞。M-CSF主要通过其受体c-Fms促进单核/巨噬细胞系前体的增殖、生存及分化，为破骨细胞生成提供足够的前体细胞。RANKL与其受体RANK结合后，激活NF-κB、MAPK及NFATc1等关键信号通路，驱动破骨细胞特异性基因（如TRAP、Cathepsin K等）的表达，并促进细胞间融合，形成多核破骨细胞。

二、材料与试剂

（1）实验动物

小鼠

（2）试剂

肝素或EDTA抗凝剂

PBS缓冲液

密度梯度介质（如Ficoll/Percoll类）

DMEM培养基

α-MEM培养基

胎牛血清FBS

青霉素-链霉素（P/S，可选）

M-CSF（20–50 ng/mL工作浓度）

RANKL（50–100 ng/mL工作浓度）

Trypsin-EDTA胰酶消化液

TRAP染色试剂盒

无菌蒸馏水/去离子水

（3）耗材与器材

无菌注射器及配套针头

无菌离心管（15 mL、50 mL）

40 µm细胞滤器

细胞培养瓶（T25/T75等）

24孔板（或其他规格多孔板）

移液器及无菌枪头

EP管/小离心管

细胞计数板（或自动细胞计数装置）

CO₂细胞培养箱

台式离心机

生物安全柜/超净工作台

倒置显微镜（TRAP后可用正置显微镜辅助观察）

三、骨髓间充质干细胞的提取与分离

（1）样本采集：在无菌条件下对实验动物（如小鼠）进行麻醉，暴露股骨或胫骨，使用注射器从骨髓腔中抽取骨髓液，立即注入预先加入肝素或EDTA抗凝剂的无菌离心管中。

（2）稀释与过滤：将骨髓液与等体积PBS充分混匀，经40 µm细胞滤器过滤，滤液收集于离心管中备用。

（3）密度梯度离心：在离心管中加入适量密度梯度介质，将稀释后的骨髓液缓慢沿管壁加入其上层，避免混匀。以400 g离心20 min。离心结束后，用移液器小心吸取界面处的单个核细胞层，转移至新的离心管中。

（4）细胞洗涤：向离心管中加入约10 mL PBS重悬细胞，以400 g离心5 min，弃去上清液。重复洗涤1–2次。

（5）细胞接种与培养：将沉淀的单个核细胞重悬于含10–20% FBS的DMEM培养基中，按1–2×10⁶cells/cm²的密度接种于细胞培养瓶中，置于37°C、5%CO₂培养箱中培养。培养24–48 h后更换培养基以去除未贴壁细胞，此后每2–3 d更换培养基一次，直至细胞融合度达70–80%。

四、骨髓间充质干细胞诱导分化为破骨细胞

（1）细胞准备：当骨髓间充质干细胞达到适宜融合度后，使用胰酶消化并收集细胞，按合适密度接种于新的培养容器（如24孔板）中，培养基为含20–50 ng/mL M-CSF的α-MEM培养基。

（2）诱导分化：细胞接种约12 h待其贴壁稳定后，更换为含20–50 ng/mL M-CSF和50–100 ng/mL RANKL的10% FBS α-MEM培养基，此后每隔1 d更换培养基，连续诱导6–8 d。

（3）破骨细胞鉴定：诱导结束后，按照TRAP染色试剂盒说明书对细胞进行酒石酸抗性酸性磷酸酶（TRAP）染色，在显微镜下观察。具有3个及以上细胞核，且胞质呈深红色至紫色的TRAP阳性细胞即判定为破骨细胞。

五、常见问答

Q1：培养几代后BMSCs形态变差，诱导效率下降？

A：这种情况多为细胞代次衰老所致，建议将诱导实验尽量控制在P2–P4代内进行；若由于实验设计必须使用高代次细胞，应在记录与发表中清楚标明代次并在讨论中说明该限制；一旦发现细胞形态明显异常，如细胞体明显膨大、长杆形和空泡增多、增殖变慢等，应考虑放弃该细胞批次并重新起始培养。

Q2：加入M-CSF和RANKL后，TRAP阳性细胞数量很少，多核细胞也不多？

A：需要优先确认所用M-CSF和RANKL的保存条件是否得当、是否经历多次冻融或超过推荐保存期；在保证细胞活力的前提下可适当提高接种密度，并对M-CSF（20–50 ng/mL）和RANKL（50–100 ng/mL）做小范围浓度梯度优化；同时注意诱导时间并非固定，部分体系在第5–7天才出现破骨细胞高峰，建议设置多个时间点（如day4、6、8）观察TRAP阳性及多核形成情况；如果更换了血清批次，诱导效率明显降低，也需要评估FBS批次差异的影响。

Q3：诱导过程中细胞大量死亡、脱落严重？

A：应先在相差显微镜下观察是否有细菌、真菌或支原体污染，如有污染需立即终止该批实验；若无明显污染，则需评估初始接种密度是否过高，导致中后期营养消耗过快、pH波动较大；同时检查换液操作是否过于剧烈，例如直接对准细胞层冲击或吸液过快，会造成贴壁细胞被剪切脱落，建议沿孔壁缓慢吸放液；此外也要警惕细胞因子浓度设置过高或者组合不当诱发应激，可尝试降低剂量或缩短诱导周期观察变化。

Q4：TRAP染色背景很深，看不清单个细胞；或者染色太浅、几乎无色？

A：若背景过深，常见原因是固定时间过长或固定液浓度偏高，此时应缩短固定时间并严格按说明书配制试剂，同时控制TRAP反应时间，建议先做10、20、30 min的时间梯度预实验；若染色过浅，应确认TRAP工作液是否临用现配、pH是否在推荐范围，并排除试剂放置过久或保存不当导致的活性下降；在细胞本身TRAP表达较弱的情况下，可以适当延长诱导时间或微调RANKL浓度，以增强破骨表型。

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