L-甲硫氨酸-¹³C₅,¹⁵N：代谢组学稳定同位素示踪剂
L-甲硫氨酸-¹³C₅,¹⁵N：代谢组学稳定同位素示踪剂
L-Methionine-¹³C₅,¹⁵N 是一种全同位素标记的必需氨基酸，其五个碳原子均被¹³C替换，氨基氮被¹⁵N替换，使其成为定量代谢通量分析、稳定同位素分辨代谢组学及基于SILAC的蛋白质组学工作流程中不可或缺的示踪剂。
- 化学名称
- L-甲硫氨酸-¹³C₅,¹⁵N
- 货号
- L471886
- 同位素替换
- 全部5个碳原子替换为¹³C；氨基氮替换为¹⁵N（共6个重原子）
- 质量偏移
- 相对于未标记L-甲硫氨酸质量偏移+6 Da
- 参考标准品
- 类似于Sigma-Aldrich编号608106
- 主要应用
- 代谢通量分析、SILAC蛋白质组学、一碳代谢示踪
- 检测方法
- 液相色谱-质谱（LC-MS）、气相色谱-质谱（GC-MS）、核磁共振（NMR）
什么是L-甲硫氨酸-¹³C₅,¹⁵N？
L-甲硫氨酸-¹³C₅,¹⁵N是必需含硫氨基酸L-甲硫氨酸的稳定、非放射性同位素异构体。在该化合物中，所有五个碳位（¹³C₅）和α-氨基氮（¹⁵N）均携带重同位素，与天然丰度形式相比，分子标称质量增加+6 Da。由于¹³C和¹⁵N是稳定且非放射性的同位素，该化合物可在标准实验室条件下操作，无需专业辐射安全设施。
甲硫氨酸在细胞生化中占据核心地位。它是蛋白质合成的通用起始氨基酸，是S-腺苷甲硫氨酸（SAM）——主要的生物甲基供体——的前体，也是通往半胱氨酸和谷胱甘肽生物合成的转硫途径中的关键节点。碳和氮位置的全标记最大化了标记池与非标记池之间的分析区分度，使质谱仪能够精确测量同位素比率。
主要研究应用
代谢通量分析（MFA）和稳定同位素分辨代谢组学（SIRM）：通过向细胞或生物体提供L-甲硫氨酸-¹³C₅,¹⁵N作为唯一甲硫氨酸来源，研究人员可以追踪标记向下游代谢物的掺入情况，包括SAM、S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）、同型半胱氨酸、胱硫醚、半胱氨酸和谷胱甘肽。在LC-MS实验中，+6 Da的明显质量偏移可将标记物种与背景信号清晰分离，从而定量绘制一碳代谢和转硫途径的通量图。
基于SILAC的定量蛋白质组学：细胞培养中氨基酸稳定同位素标记（SILAC）依赖于重氨基酸代谢掺入新合成蛋白质中。L-甲硫氨酸-¹³C₅,¹⁵N可作为SILAC工作流程中的重甲硫氨酸通道，通过比较质谱数据中的重/轻肽段比率，实现实验条件之间蛋白质表达变化的精确相对和绝对定量。
表观遗传学和甲基化研究：由于甲硫氨酸是SAM——DNA、RNA和组蛋白甲基转移酶甲基供体——的必需前体，同位素标记甲硫氨酸使研究人员能够测量细胞甲基化反应的动态变化。标记甲硫氨酸中的¹³C和¹⁵N掺入甲基化核苷酸或氨基酸残基甲基基团中的情况可通过高分辨率质谱检测，为表观遗传调控机制提供深入见解。
实验注意事项与最佳实践
细胞培养标记：为在细胞培养实验中实现完全同位素掺入，应使用不含甲硫氨酸的基础培养基，并仅以生理相关浓度的L-甲硫氨酸-¹³C₅,¹⁵N补充（哺乳动物细胞培养通常为100–200 µM，但应根据具体细胞系和实验设计进行确认）。SILAC稳态同位素富集所需标记时间通常为数个倍增周期，通量实验则为较短的脉冲标记时间。
样品制备与质谱分析：收获时应迅速淬灭代谢（如用冷甲醇/水混合物或液氮），以保留同位素标记模式。代谢组学分析推荐蛋白质沉淀后在高分辨率仪器（如Orbitrap或Q-TOF）上进行LC-MS分析。应使用同位素分布分析软件校正天然同位素丰度贡献，并提取代谢通量信息。
储存与操作：冻干或固态L-甲硫氨酸-¹³C₅,¹⁵N应在–20°C下避光防潮储存。在水或稀盐酸中制备储备液；避免反复冻融以保持同位素和化学完整性。在定量实验使用前，通过NMR或LC-MS确认纯度和同位素富集度。
常见问题
L-甲硫氨酸-¹³C₅,¹⁵N相对于未标记L-甲硫氨酸的质量偏移是多少？
L-甲硫氨酸-¹³C₅,¹⁵N携带五个¹³C原子（每个+1 Da）和一个¹⁵N原子（+1 Da），相对于未标记化合物产生+6 Da的总质量偏移。这一较大的偏移有助于通过质谱仪明确检测和定量标记代谢物。
L-甲硫氨酸-¹³C₅,¹⁵N能否用于SILAC蛋白质组学实验？
可以。当L-甲硫氨酸-¹³C₅,¹⁵N作为SILAC细胞培养基中唯一甲硫氨酸来源时，可被掺入新合成的蛋白质中。每个甲硫氨酸残基+6 Da的质量偏移使LC-MS/MS能够定量比较重标和轻标蛋白质组之间的肽段丰度。
应如何储存L-甲硫氨酸-¹³C₅,¹⁵N以保持其完整性？
将该化合物储存在–20°C密封防潮避光容器中。将水溶液储备液新鲜制备或分装为单次使用等份，以避免反复冻融导致降解。在关键定量实验使用前，通过LC-MS或NMR验证同位素纯度。
使用L-甲硫氨酸-¹³C₅,¹⁵N作为示踪剂可以研究哪些代谢途径？
该示踪剂特别适用于研究甲硫氨酸循环、一碳代谢、转硫途径和多胺生物合成。下游标记代谢物包括SAM、SAH、同型半胱氨酸、胱硫醚、半胱氨酸、谷胱甘肽以及甲基化核苷酸或蛋白质，均可通过高分辨率质谱分辨检测。
为什么对甲硫氨酸选择¹³C/¹⁵N标记而非氘标记？
与氘标记不同，¹³C和¹⁵N取代不会改变标记化合物相对于未标记对应物在反相LC-MS中的色谱保留时间，确保共洗脱和准确的比率测量。这使¹³C/¹⁵N标记甲硫氨酸成为定量代谢组学和蛋白质组学工作流程的首选标准品。
参考文献
- Sigma-Aldrich Product Information: L-Methionine-¹³C₅,¹⁵N, Cat. No. 608106.
- Ong, S.E. et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & Cellular Proteomics, 2002.
- Locasale, J.W. Serine, glycine and one-carbon units: cancer metabolism in full circle. Nature Reviews Cancer, 2013.
- Buescher, J.M. et al. A roadmap for interpreting ¹³C metabolite labeling patterns from cells. Current Opinion in Biotechnology, 2015.
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