细胞衰老是细胞在损伤或应激作用下形成的稳定增殖停滞状态。衰老细胞持续积累及其衰老相关分泌表型可促进慢性炎症和组织功能障碍，而衰老细胞清除剂可通过破坏其抗凋亡网络，选择性诱导衰老细胞死亡。

        关键词：细胞衰老；衰老细胞清除剂；Senolytics；衰老相关分泌表型；SASP；SCAP；达沙替尼；槲皮素；漆黄素；Navitoclax

1 细胞衰老的形成与生物学特征

1.1 细胞衰老的概念

        细胞衰老（cellular senescence）是细胞受到复制压力、DNA损伤或其他应激刺激后形成的长期且通常难以逆转的增殖停滞状态。衰老细胞仍保持一定代谢活性，但不能正常进入细胞周期，并伴随染色质结构、细胞器功能、基因表达和分泌活动改变。与可恢复增殖的细胞静止不同，衰老细胞通常受到p53/p21和p16INK4a/RB等稳定性细胞周期抑制网络限制。

1.2 复制性衰老

        正常体细胞连续分裂会导致端粒逐渐缩短，当端粒无法继续维持染色体末端稳定时，可引起持续性DNA损伤反应，并通过ATM/ATR、p53/p21和p16INK4a/RB通路抑制细胞周期。复制性衰老常见于正常人成纤维细胞及其他有限增殖能力的体细胞长期传代模型。

1.3 应激诱导的早熟衰老

        电离辐射、氧化应激、化学损伤、线粒体功能障碍、蛋白质稳态失衡和代谢压力可在不伴随明显端粒缩短的情况下诱导细胞衰老。应激诱导的早熟衰老形成速度较快，适合建立体外模型，但不同刺激产生的衰老相关分泌表型和抗凋亡通路依赖并不完全相同。

1.4 致癌基因诱导的衰老

        RAS、BRAF等致癌信号持续激活可导致异常复制、DNA损伤和氧化应激，促使细胞进入致癌基因诱导的衰老。该过程能够限制潜在恶性细胞持续增殖，是早期肿瘤抑制的重要屏障；若衰老细胞未被及时清除，其分泌因子也可能促进周围细胞生长、炎症和组织重塑。

1.5 治疗诱导的衰老

        化疗、放疗及部分靶向治疗可使肿瘤细胞或正常组织细胞进入治疗诱导的衰老。短期增殖停滞能够限制肿瘤扩增，但长期残留的衰老细胞可能通过炎症因子、趋化因子和基质重塑分子影响肿瘤微环境，并增加组织损伤及复发相关风险。

1.6 细胞衰老的双重作用

        短期、受控的细胞衰老可参与胚胎发育、伤口愈合、组织重塑和肿瘤抑制，随后衰老细胞通常由巨噬细胞、自然杀伤细胞和其他免疫细胞清除；当衰老细胞持续形成或免疫清除能力下降时，其会在组织内积累并产生病理作用。因此，衰老干预的重点是识别并清除持续存在的病理性衰老细胞，而不是无差别消除所有衰老反应。

图1 衰老细胞积累与Senolytic介导的选择性清除机制

2 衰老细胞的主要表型与检测指标

2.1 稳定性细胞周期停滞

        衰老细胞通常表现为DNA合成减少、Ki-67等增殖标志物下降，以及p16INK4a、p21CIP1和p53等细胞周期调节蛋白变化。EdU或BrdU掺入降低可反映DNA复制受抑，但类似变化也可见于细胞静止、分化和营养不足，因此不能单独作为衰老判定依据。

2.2 衰老相关β-半乳糖苷酶

        衰老相关β-半乳糖苷酶（senescence-associated β-galactosidase，SA-β-gal）活性升高是常用的细胞衰老检测指标，通常在pH 6.0条件下进行组织化学或荧光检测。该指标主要反映衰老细胞溶酶体质量和酶活增加，但过度融合、长期培养及部分非衰老细胞也可能呈阳性。

2.3 DNA损伤与染色质改变

        衰老细胞可出现持续性γ-H2AX和53BP1焦点、端粒相关DNA损伤、衰老相关异染色质焦点以及核纤层蛋白Lamin B1下降。持续性DNA损伤焦点有助于区分稳定衰老与短暂应激，但具体表现会受到细胞来源、诱导方式和检测时间影响。

2.4 细胞形态与细胞器变化

        衰老细胞通常体积增大、形态扁平、胞质颗粒度增加，并伴随溶酶体增多、线粒体功能异常、活性氧积累和自噬通量改变。衰老细胞仍可能保持较强代谢活性，因此CCK-8等代谢检测结果正常或升高并不能排除细胞衰老。

2.5 多指标联合判定

        较可靠的细胞衰老判定应同时包括长期增殖停滞、SA-β-gal活性升高、p16或p21变化、持续性DNA损伤、Lamin B1下降和衰老相关分泌表型等相互独立的证据。由于不存在适用于所有组织和细胞类型的单一衰老标志物，实验中通常应选择至少三类指标进行联合判断。

3 衰老相关分泌表型及其组织效应

3.1 SASP的组成

        衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP）包括IL-6、IL-8和IL-1家族炎症因子，CCL和CXCL家族趋化因子，多种生长因子、基质金属蛋白酶、蛋白酶抑制剂、细胞外基质成分及生物活性脂质。SASP不是固定的分泌组合，而会随细胞类型、衰老诱因、衰老持续时间和组织环境变化。

3.2 SASP的生理作用

        短期SASP可促进免疫细胞募集、组织重塑、血管生成及伤口修复，并帮助免疫系统识别和清除衰老细胞。适度的SASP还可调节干细胞和邻近细胞的再生反应，限制受损细胞继续增殖。

3.3 SASP的病理作用

        持续性SASP可使邻近细胞发生DNA损伤、炎症激活或旁分泌性衰老，并改变细胞外基质、干细胞生态位和免疫细胞组成。即使衰老细胞在组织中的比例较低，也可能通过旁分泌和炎症放大效应持续影响组织功能。

3.4 SASP与年龄相关疾病

        衰老细胞和SASP积累与动脉粥样硬化、骨关节炎、肺纤维化、肾脏疾病、代谢异常、神经退行性疾病及肿瘤微环境重塑有关。不同疾病中的主要衰老细胞来源、SASP组成和抗凋亡通路依赖存在差异，因此需要根据具体组织和细胞亚群选择干预靶点。

4 衰老细胞抗凋亡通路与Senolytics

4.1 SCAP的形成

        衰老细胞长期处于DNA损伤、氧化应激、炎症刺激和蛋白质稳态压力下，却不会立即死亡，其重要原因是增强了衰老细胞抗凋亡通路（senescent cell anti-apoptotic pathways，SCAP）。SCAP可涉及BCL-2、BCL-XL、BCL-W、PI3K/AKT、受体酪氨酸激酶、p53调节网络、HSP90及其他存活信号。

4.2 Senolytics的作用机制

        衰老细胞清除剂（senolytics）通过暂时抑制衰老细胞高度依赖的存活通路，使其重新获得对线粒体凋亡、氧化损伤和蛋白质稳态压力的敏感性。非衰老细胞对相同通路的依赖程度可能较低，因此在适当剂量和处理时间下可形成选择窗口，但这种选择性会受到细胞来源、衰老诱因和组织环境影响。

4.3 BCL-2家族靶向策略

        部分衰老细胞通过提高BCL-2、BCL-XL或BCL-W活性抵抗线粒体凋亡。Navitoclax、ABT-737、A1331852和A1155463等化合物可解除这种抗凋亡保护，但BCL-XL同时参与血小板和正常细胞存活，因此应用时需要评价靶点相关毒性及治疗窗口。

4.4 酪氨酸激酶与PI3K/AKT靶向策略

        达沙替尼可抑制多种酪氨酸激酶，槲皮素可影响PI3K/AKT、氧化应激和炎症信号。二者联用能够覆盖部分对单药敏感性不同的衰老细胞，是常用的Senolytic组合，但其作用具有明显的细胞类型和衰老模型依赖性。

4.5 HSP90靶向策略

        HSP90能够维持多种激酶和存活蛋白的稳定性，部分衰老细胞依赖HSP90缓解蛋白毒性和凋亡压力。Geldanamycin、Tanespimycin和Alvespimycin等HSP90抑制剂可破坏这一保护网络，用于研究HSP90依赖型衰老细胞清除。

4.6 氧化还原与离子稳态靶向策略

        部分衰老细胞长期处于较高的氧化应激和离子稳态压力下，对进一步增加活性氧或改变膜电位更加敏感。Piperlongumine可破坏氧化还原平衡，Ouabain和Digoxin等强心苷则可抑制Na⁺/K⁺-ATPase并改变离子稳态，但这些化合物的选择窗口和正常细胞毒性必须单独评价。

4.7 Senolytics与Senomorphics

        Senolytics的主要目标是选择性诱导衰老细胞死亡，而衰老表型调节剂（senomorphics或senostatics）主要降低SASP或减弱衰老细胞的不良作用，并不一定清除细胞。Rapamycin、二甲双胍、白藜芦醇、姜黄素和木犀草素更常用于mTOR、AMPK、NF-κB、氧化应激及SASP调节研究，不能仅凭抗炎或抗氧化作用将其归类为Senolytics。

5 代表性Senolytics及其作用特点

5.1 达沙替尼与槲皮素

        达沙替尼（dasatinib）是一种多靶点酪氨酸激酶抑制剂，槲皮素（quercetin）是一种天然黄酮醇。达沙替尼对部分衰老前脂肪细胞表现出较强作用，槲皮素则对部分衰老内皮细胞和其他模型具有一定活性，二者联合可扩大对不同衰老细胞亚群的覆盖范围，但不能清除所有类型的衰老细胞。

5.2 漆黄素

        漆黄素（fisetin）是一种天然黄酮醇，在部分细胞和动物模型中可降低衰老细胞负担、调节SASP并影响抗凋亡信号。由于漆黄素同时具有抗氧化、抗炎和代谢调节作用，其实验效应不能全部归因于衰老细胞清除，需要通过衰老细胞与非衰老细胞的平行毒性比较验证选择性。

5.3 Navitoclax

        Navitoclax（ABT-263）可抑制BCL-2、BCL-XL和BCL-W，解除部分衰老细胞对BCL-2家族的依赖。该化合物在多种衰老模型中具有较明确的清除活性，但可能影响血小板及其他依赖BCL-XL的正常细胞，因此适合用于机制研究、给药优化及靶向递送研究。

5.4 BCL-XL选择性抑制剂

        A1331852和A1155463主要靶向BCL-XL，可用于判断衰老细胞是否依赖BCL-XL维持存活。此类化合物有助于解析衰老细胞抗凋亡网络，但BCL-XL本身具有重要生理功能，仍需重点评价对血小板和正常组织的影响。

5.5 Piperlongumine

        Piperlongumine可增加氧化应激并削弱部分衰老细胞的抗氧化防御。由于衰老细胞往往已经处于较高的活性氧压力下，其可能对进一步的氧化还原干扰更加敏感，但应结合活性氧、谷胱甘肽水平和非衰老细胞毒性验证其选择性。

5.6 HSP90抑制剂

        Geldanamycin、Tanespimycin和Alvespimycin可抑制HSP90伴侣蛋白功能，导致多种存活相关客户蛋白失稳。HSP90抑制剂对部分衰老细胞具有清除活性，但同样可能影响正常增殖细胞，因此需要通过剂量梯度、处理时间和间歇性给药建立选择窗口。

5.7 强心苷类化合物

        Ouabain和Digoxin等强心苷可抑制Na⁺/K⁺-ATPase，改变膜电位、离子梯度和细胞内酸碱稳态。部分衰老细胞因离子调节能力改变而表现出较高敏感性，但强心苷治疗窗口较窄，不适合仅依据单一细胞活性结果判定其Senolytic作用。

5.8 原花青素C1

        原花青素C1（procyanidin C1，PCC1）是一种天然多酚，在不同浓度和处理条件下可能表现出SASP调节或衰老细胞清除作用。研究中应分别评价其抗氧化效应、Senomorphic效应和对衰老细胞的选择性杀伤能力。

6 达沙替尼联合槲皮素的研究基础

6.1 细胞水平研究

        达沙替尼和槲皮素联合应用的基础是不同衰老细胞对SCAP的依赖不同。两种化合物分别对部分衰老前脂肪细胞、衰老内皮细胞及其他模型表现出不同敏感性，联合处理能够扩大作用范围，因此Senolytics筛选不应只采用单一细胞来源或单一衰老诱导方式。

6.2 衰老细胞移植模型

        将衰老细胞移植至动物体内可引起运动能力、耐力和组织功能下降，并促进宿主组织出现衰老相关变化。间歇性达沙替尼联合槲皮素处理可在部分模型中降低衰老细胞负担并改善生理功能，支持衰老细胞积累与组织功能障碍之间存在因果联系。

6.3 自然衰老与疾病模型

        达沙替尼联合槲皮素已被用于自然衰老、肺纤维化、肾脏疾病、骨骼功能异常和代谢紊乱等研究模型。不同组织中的药物暴露、衰老细胞来源和SCAP依赖差异明显，因此一个模型中的有效条件不能直接套用于其他疾病或细胞体系。

6.4 研究结论的边界

        Senolytics在部分动物模型中能够改善年龄相关病理和功能指标，但衰老还涉及基因组不稳定、表观遗传改变、蛋白质稳态丧失、线粒体功能下降、干细胞耗竭和细胞间通讯异常。清除衰老细胞只能干预其中部分机制，不能据此认定其能够全面逆转人类衰老。

7 Senolytics的实验设计与评价

7.1 衰老模型的建立

        常用模型包括长期传代形成的复制性衰老、辐射或DNA损伤剂诱导的早熟衰老、致癌基因诱导的衰老、氧化应激诱导的衰老和抗肿瘤治疗诱导的衰老。不同模型形成的SASP和SCAP差异明显，实验中应明确诱导条件、恢复时间和衰老成熟阶段。

7.2 衰老模型的确认

        给药前应通过SA-β-gal、EdU或BrdU掺入、p16、p21、Lamin B1、γ-H2AX和SASP等指标确认细胞已形成稳定衰老。若细胞仅处于暂时性增殖减慢或急性损伤状态，药物产生的细胞毒性不能解释为Senolytic作用。

7.3 选择性清除评价

        Senolytic活性应在衰老细胞和对应非衰老细胞中平行评价，比较细胞存活率、凋亡比例、半数有效浓度和最大效应。仅观察衰老细胞数量减少不能排除广谱毒性，应计算衰老细胞与非衰老细胞之间的选择窗口。

7.4 凋亡机制验证

        Senolytics通常通过解除抗凋亡保护诱导细胞死亡，可检测Annexin V、Caspase-3/7活性、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP、细胞色素c释放和线粒体膜电位变化。加入Caspase抑制剂或敲低关键SCAP蛋白，可进一步验证药物是否通过凋亡通路清除衰老细胞。

7.5 衰老细胞负担评价

        药物处理后应检测SA-β-gal阳性率、p16、p21、Lamin B1、DNA损伤焦点和SASP变化，并结合总细胞数及死亡指标解释。衰老标志物降低可能来自衰老细胞清除、表型抑制或检测信号改变，不能仅凭单一标志物下降得出清除结论。

7.6 SASP检测

        可通过ELISA、免疫印迹、多因子检测或转录分析测定IL-6、IL-8、趋化因子和基质金属蛋白酶。SASP下降不一定代表衰老细胞已经死亡，也可能由Senomorphic作用、细胞代谢下降或总体细胞数量减少引起。

7.7 动物与转化研究终点

        动物研究应同时评价衰老细胞负担、组织炎症、纤维化、肌力、运动耐量、器官功能和药物毒性。只有当衰老标志物降低与组织功能改善相一致，并且正常组织未出现明显损伤时，才能说明清除衰老细胞具有较明确的功能意义。

8 产品

        Senolytics研究应证明候选化合物能够优先清除衰老细胞，而不是仅降低衰老标志物或产生广谱细胞毒性。实验中需结合非衰老细胞对照、凋亡验证、SASP检测和组织功能评价，明确其选择性及作用边界。

参考文献

[1] Xu M, et al. Senolytics improve physical function and increase lifespan in old age. Nature Medicine. 2018;24(8):1246-1256.

[2] van Deursen JM. Senolytic therapies for healthy longevity. Science. 2019;364(6441):636-637.

更多相关文章，详见下方：

[1] 氧化应激相关研究进展汇总

[2] 报告基因：β-半乳糖苷酶的原位染色实验