产品描述：
应用：用于从糖蛋白治疗剂中释放中性和氨基单糖，并随后用 2-氨基苯甲酸 (2-AA) 进行标记。

描述：该试剂盒包含从糖蛋白生物药物和标准品中释放单糖的试剂。释放的单糖有一个游离的还原末端，可以通过还原胺化进行荧光标记。提供了两种水解酸， 2 摩尔三氟乙酸 (2M TFA) 和 6 摩尔盐酸 (6M HCl)。通常，对于试点研究，我们建议在样品中单独并重复使用这两种酸，因为我们发现 2M TFA 有利于释放中性单糖，但对 N-乙酰氨基葡萄糖 (GlcNAc) 和 N-乙酰半乳糖胺 (GalNAc) 效果较差。我们推荐使用 6M HCl 的单糖释放。经过初步研究，可以确定仅使用 6M HCl 水解步骤就足以对您的糖蛋白进行定量分析。盐酸以及提供更有效的 GlcNAc 释放也可能有助于核心岩藻糖和核心甘露糖的释放；然而，后一种单糖会被 HCl 降解，因此应注意以一致的方式进行水解，我们建议同时水解单糖标准品以进行校准。

样品数量：该试剂盒包含用于平行分析96个糖蛋白样品或两组48个样品的试剂和材料。

样品量：通常，每个样品约50µg糖蛋白取决于存在的聚糖水平，这应在试点研究中确定。

适用样品：生物制药糖蛋白。

储存：将整个试剂盒在 4°C 下避光储存。 一旦单糖标准溶解在溶剂，我们建议将它们储存在 -20°C。 远离热源、光源和水分。 在购买后 6 个月内使用套件。

运输：产品应在环境温度下运输，但可在 4°C 下储存至 6 个月。

套件内容

该试剂盒包含以下材料和试剂：

 
需要额外的试剂和设备:

• 纯水：电阻率高于 18 MΩ-cm，无颗粒 (>0.22 μm)，TOC <10 ppb

• 用于从糖蛋白中去除盐分和去污剂的透析膜、PD10 柱或类似物样品

• 小瓶 - 用于水解的螺旋盖聚丙烯小瓶。 0.5 mL 体积是理想的。 小瓶盖应密封密封并带有 O 型圈以防止酸蒸汽逸出。 我们不建议使用按扣帽类型的小瓶，例如用于 PCR 的小瓶，除非它们被设计为无需夹紧即可牢固安装。

• 用于孵化阶段（推荐）或加热块的烤箱。 请注意，经常使用加热块导致一些样品溶剂蒸发到样品瓶盖中，这可能会降低样品的有效性水解或标记。

• 离心蒸发器

• 涡旋器和超声波仪

• 移液器

• 对于 HPLC 溶剂：丁胺，>99.5%

                                四氢呋喃，无水 >99.9%，BHT 抑制剂

                                正磷酸约85%浓度

                                乙腈

• 可选 - 取决于您的样品。 高浓度的盐可能会抑制荧光团标记。 木糖内部控制可作为高盐标记抑制是否发生的指导。

程序时间线

贴标过程通常需要 14 小时

使用说明

分配和干燥样品

1. 将 50 µg 每个糖蛋白样品分装到 0.5 mL 螺旋盖聚丙烯小瓶中，一式三份。

每次分析需要两份样品——一份用于 2M TFA 水解，一份用于 6M HCl 水解。 理想情况下，每种溶液的体积不应超过 200 µL，以防止样品在离心干燥过程中从小瓶中流失。 建议使用 0.5 mL 带 O 形圈的螺帽小瓶（在水解步骤中，卡口盖类型的小瓶可能会失效）。

2 . 样品空白 - 将等量的样品缓冲液分装到 0.5 mL 螺旋盖聚丙烯瓶中，一式三份。

3 .通过离心蒸发干燥样品，不要加热。 样品应在三小时内干燥，具体取决于真空效率。

水解样品

4. 向干燥的样品中加入 200 µL 用于中性单糖分析（Gal、Man、Glc、Fuc、Xyl）

涡旋 10 秒并拧紧盖子，以确保在加热步骤期间不会从管中蒸发。

在这个阶段，您还应该在干燥的 10 nmol 单糖标准品 (CM-Mono-Mix-10) 中添加酸。

5. 向干燥的样品中加入 200 µL 用于 N-乙酰半乳糖胺和 N-乙酰氨基葡萄糖分析 (GalNAc, GlcNAc)

6M HCl 在释放 GalNAc 和 GlcNAc（可能还有核心岩藻糖和甘露糖）单糖方面比 2M TFA 更有效，但会部分破坏中性单糖。

6. 将小瓶放入烤箱

在烘箱中以 100°C 加热样品 3 小时。样品应在 30 分钟后重新混合，以确保糖蛋白溶解在酸中。如果使用热板代替烘箱，则需要使用更小的样品瓶或更大体积的酸，以防止所有酸在样品瓶盖上蒸发和冷凝，从而不能充分水解样品。

请注意，科学文献中报道了许多不同的水解条件，我们建议您使用自己的糖蛋白优化这些条件。

冷却然后干燥样品

7. 从烤箱中取出小瓶并让它们冷却，离心以确保所有样品都在小瓶中而不是盖子中。

8. 我们建议使用木糖单糖作为内标。为此，我们提供了100 nmol量的木糖。将木糖溶解在一定量的水中（例如200µl），充分混合以确保完全溶解，然后将一定量的木糖添加到每个测试样品中（例如10 nmol或20µl溶解样品）。通常，在对样品进行初步调查并确定测试样品中木糖的存在和单糖的绝对水平后，使用木糖在全面研究中更有效。木糖不建议作为植物细胞表达系统表达的蛋白质的标准。

9. 松开小瓶盖并在离心蒸发器中蒸发酸

此阶段最多需要4小时。干燥2小时后，检查瓶盖O形圈是否密封管，防止样品干燥。许多样品会干燥成深褐色或黑色斑点。

化学标记样品

10.预热烤箱/热板至80°C

请注意，我们建议使用烘箱，因为这样可以防止任何溶液在样品盖中凝结。

11.在 80°C 下孵育样品 45 分钟，确保小瓶盖盖紧。

稀释样品

12. 从培养箱中取出样品并让其冷却

将样品冷却至室温，然后在离心机中短暂旋转以去除瓶盖中的冷凝物。

13. 稀释样品 冷却并离心后，标记的样品准备好进行分析，浓缩后注入 HPLC 柱。将样品稀释到丁胺/正磷酸/四氢呋喃 (BPT) HPLC 运行溶剂中。对于单糖标准品，我们建议将样品稀释 100 倍，但准确的稀释度取决于荧光检测器的灵敏度和糖蛋白的聚糖含量。请参阅本文档的校准曲线部分。作为指导，抗体样品应稀释 20 至 50 倍，因为每个分子通常只有两个糖基化位点。牛胎球蛋白糖蛋白标准品通常在 100 倍稀释下运行，其中胎球蛋白约为 20% w/w 聚糖。样品稀释后，我们建议对样品进行 30 分钟的超声处理，以去除稀释阶段产生的任何气体。在超声处理期间，小瓶可以保持封盖。如果没有超声波仪，样品可以在稀释后放置大约 12 小时，然后轻轻混合以去除气泡。 12 小时后不会再释放气体。

样品的 HPLC 分析

溶剂

本指南中的糖链分析梯度基于以下溶剂：

溶剂A：0.2%丁胺（2毫升/升）、0.5%磷酸（5毫升/升）、1%四氢呋喃（10毫升/升）的纯水基溶剂（以下称为BPT溶剂）。 溶剂 B：50% 乙腈：50% 溶剂 A 我们还测试了不含乙腈的溶剂系统。 这需要稍微不同的梯度。 详情请咨询。 色谱柱应长期存放在 30% 溶剂 B 中。

我们还测试了无乙腈溶剂系统。 这需要稍微不同的梯度。 详情请咨询。 色谱柱应长期存放在 30% 溶剂 B 中。

坡度

柱温：30 °C 荧光检测器设置：激发波长：360 nm，发射波长：425 nm

校准曲线

我们建议将五点校准曲线用于单糖标准品。如果您同时使用了 HCl 和 TFA 水解条件，则需要为一组，用每种酸水解的单糖标准品绘制​​校准曲线。将水解的单糖混合物稀释到 BPT 溶剂中。我们建议使用以下稀释度，但这些稀释度可能会因样品中的糖基化水平而异。始终运行允许您将样品结果放置在曲线内的标准曲线。移取大于 5 µl 的体积通常更准确。

1in 100（25 µl 水解的单一混合物标准品 + 2475 µl BPT）

1in 125（20 µl 水解单混标准溶液 + 2480 µl BPT）

1in 167（15 µl 水解单混合标准品 + 2485 µl BPT）

1 英寸 250（20 µl 水解单体标准溶液 + 4980 µl BPT）

1in 500（10 µl 水解的单一混合物标准品 + 4990 µl BPT）

对样品进行超声处理以去除气泡。在这个阶段不需要松开小瓶盖。

数据解释

2-AA 单糖的 HPLC 分析是确定糖蛋白样品中单糖水平的可靠方法。有一些重要的问题需要理解才能实现有效的数据解释。

1. 每种单糖每 nmol 具有不同的荧光产量。需要确定单糖浓度与荧光的标准曲线。

2. 标记后不会从样品中去除游离染料，以确保在染料清理阶段不会丢失单糖。游离染料在约 15 分钟时以大的超标峰形式洗脱（图 1），在 28 分钟后也出现几个大峰。

3. N-乙酰氨基葡糖和N-乙酰半乳糖胺在该工艺的酸水解步骤中均被去-N-乙酰化，分别产生氨基葡萄糖和半乳糖胺。

4. 葡萄糖胺经过大约 4% 的差向异构化，产生甘露糖胺（图 2）。甘露糖胺在半乳糖胺峰之前立即洗脱，没有基线分辨率。

5. 半乳糖胺还会产生一个差向异构体峰（图 1 – GalN 后立即出现小峰），通常小于 2%。然而，该差向异构体峰通常与游离染料峰一起洗脱。

6. 使用木糖作为内标（图 3）可以直接比较样品。这允许补偿在样品处理过程中可能发生的任何移液/样品制备错误。

7. 样品稳定性——如果您打算将带标签的样品保存一周以上，我们建议您将带标签的样品保存在 -20 °C 的冰箱中。

图 1：单糖葡萄糖胺 (GlcN)、半乳糖胺 (GalN)、半乳糖 (Gal)、甘露糖 (Man) 和岩藻糖 (Fuc) 的荧光色谱图。 葡萄糖在 Man 峰后立即洗脱。 木糖在 Fuc 峰之前洗脱。

图 2：单糖氨基葡萄糖 (GlcN) 的荧光色谱图。 该色谱图显示了 GlcN 的差向异构体峰。

图 3：单糖内参木糖 (Xyl) 的荧光色谱图。

故障排除指南

以下是与单糖分析相关的最可能问题、可能原因和解决方案的指南。

低产量或高样品间变异性

样品未完全溶解。

在标记之前，水解的样品很难溶解在 1% 的醋酸钠中。在黑色/棕色水解样品的情况下，当样品没有溶解时很清晰，但是，并非所有样品颗粒都容易看到。为确保样品具有良好的溶解度，请摇动超声处理样品瓶，而不仅仅是涡旋。溶解后，短暂离心样品。

移液的可变性

确保移液器已校准并且使用的移液器吸头是最大回收类型。

稀释的样品没有充分脱气。稀释后不久在样品中发生气体产生/置换。我们建议在脱气过程完成后（如果在冰箱中放置稀释后最多 12 小时，或在超声浴中 30 分钟后）在 HPLC 上运行样品，否则气泡可能会注入 HPLC 色谱柱，导致大样本到样本的变化。释放的气体足够低，无需松开样品瓶盖。

样品瓶中的沉淀

大量染料/还原剂过量

为了获得良好的标记效率，可以使用大量摩尔过量的染料和还原剂以形成游离单糖。 这有时会导致样品中形成混浊的沉淀物。 降低标记反应中染料和还原剂的浓度可能有助于防止沉淀的发生。

旧溶剂

确保每次色谱运行的 HPLC 溶剂都是新鲜的。

溶剂制备不一致

确保准确分配溶剂组分。有时吸管尖端会滴落，因为它们与所分配的溶剂不兼容。在分配时，溶剂组分的称重通常用作体积使用的替代方法。

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