背景

核酸酶P1（酶代码EC3.1.30.1；核酸酶5’-核苷酸水解酶，3’-磷酸水解酶）是一种细胞外酶，由Kuninaka等人于1957年在柠檬青霉菌的水提取物中首次鉴定。Fujimoto等人（1974）证明，它是一种单链特异性核酸酶，对单链核酸和双链核酸中的单链区域具有高选择性。核酸酶P1是分子生物学中应用最广泛的单链特异性核酸酶之一；其选择性在核酸结构研究中有着重要的应用。

反应

核酸酶P1同时具有磷酸二酯酶和单酯酶活性。它水解RNA和热变性DNA中的3’-5’-磷酸二酯键以及由3’-磷酸终止的单核苷酸和寡核苷酸中的3’-磷酸单酯键，无碱基特异性。虽然该酶本质上是碱基非特异性的，但已经表明，裂解速率确实取决于碱基5'与裂解键的同一性（Box，et al，1993；Romier et al，1998）。

核酸酶P1通过协同的内切和外切作用攻击RNA和单链DNA，能够水解到5’-单核苷酸水平（图1）。多核苷酸发生快速裂解，形成单核苷酸和寡核苷酸。水解初始阶段产生的寡核苷酸具有3’-OH和5’-PO4末端。

高纯度核酸酶P1具有磷酸单酯酶活性，可产生核苷和无机磷酸盐（图2）。核糖核苷3’-单磷酸的水解速度比相应的2-脱氧核糖核苷酸快20-50倍。该酶对3’-核糖核苷酸的碱基偏好为G>A>C>U，而对3’-脱氧核苷酸的碱基偏好为C≥T> A≥G

核酸酶P1的磷酸二酯酶和磷酸单酯酶活性均依赖于锌。该酶每个单体包含三个锌离子，这些锌离子结合在一个裂缝中，形成常规双链底物无法访问的活性位点（Romier等人，1998年）。两个锌离子形成一个紧密分布的双核对，埋在口袋底部，激活攻击水。第三个锌离子距离更远，更容易接触溶剂。该酶优先攻击核苷酸的3’-羟基和相邻核苷酸的5’-磷酸基之间的连接（图3）。第三，更多暴露的锌离子稳定剩下的3’-氧阴离子。

架桥Zn1和Zn3的氢氧根离子（阴影球体）通过Asp45正确定向，正沿着P-O38键攻击磷酸盐。在由此产生的五配位过渡态中，进攻的氢氧化物和离开的O38占据顶端位置。Zn2+稳定了剩余的O-38-氧阴离子，而R48中和了过渡态的额外负电荷。硫磷或二硫代磷的Rp硫与Zn2之间的空间位阻将阻止裂解。（改编自Romier等人，1998。核酸酶P1对单链DNA的识别：与底物类似物复合物的高分辨率晶体结构。蛋白质：结构、功能和遗传学。32:414-424。）

P1不能与abasic 5'核苷酸裂解磷酸二酯键，而3'核苷酸碱基的去除不会影响水解（Weinfield等，1993）。5’-碱基的芳香性影响活性，表明其可能参与与芳香蛋白质侧链的堆积相互作用。5’-碱基的重要性通过以下发现得到了加强：虽然P1基本上是非特异性的，但该酶的裂解速率在一定程度上取决于5’-碱基对裂解键的特性。

图1：核酸酶P1的磷酸二酯酶活性

图2：核酸酶P1的磷酸单酯酶活性

图3:P1核酸酶的拟议催化机制。

结构

核酸酶P1是一条估计分子量为36 kDa的单链多肽。它是一种糖蛋白，含有甘露糖、半乳糖和氨基葡萄糖，比例约为6:2:1（藤本，1975）；它含有大量疏水性氨基酸，如酪氨酸和色氨酸。Maekawa等人（1991）对核酸酶P1的直接测序表明，它包含270个氨基酸，计算分子量为29221。在SDS凝胶上观察到的36000-37000分子量相当高，可能是由天冬酰胺残基92、138、184和197上的四个N-糖基化引起的。这些翻译后修饰使碳水化合物的质量增加19%。核酸酶P1中不存在游离巯基，但在Cys-80和Cys-85以及Cys-72和Cys-217之间存在两个二硫键

核酸酶P1的三维结构已从四方晶体中以2.8A分辨率测定（Volbeda等人，1991年），从正交晶体中以2.2 A分辨率测定（Snuck等人，1993年）。三维结构如下图所示（图4）。

图4：核酸酶P1的三维结构

物理化学性质

核酸酶P1的等电点约为4.5。磷酸二酯酶和单酯酶活性的最适温度为70oC；热活性的增加归因于酶结构中存在大量疏水氨基酸。该酶在pH 5和8之间以及低于60℃的温度下稳定。天然单链DNA和RNA的水解在pH 5左右最大；聚（A）和聚（C）在pH 6下快速水解，但在pH 4.5下具有高度抗性。聚（U）和聚（I）在pH 4和5之间很容易裂解，但在pH 6下非常缓慢。磷酸单酯酶对3’-核苷酸的活性在pH 4.5左右最为理想。3’-rCMP和3’-rUMP的活性在pH值为6时最高，在pH值为7.2和8.5时，酶分别非常迅速地攻击3’-rAMP和3’-rGMP。

胍等变性试剂强烈抑制活性；然而，变性似乎是可逆的。该酶也通过透析和pH 5失活，并通过添加1 mM Zn2+几乎完全重新激活。透析去除三种锌离子中的一种，在pH 5下添加0.02 M EDTA后观察到完全失活；通过添加Zn2+可部分恢复活性。

应用

核酸酶P1历来用于从酵母RNA中工业化生产5’-单核苷酸。5′核苷酸，尤其是5′GMP，在食品中表现出增强风味的特性。5'GMP与谷氨酸钠具有协同作用，因此可以在各种食品中大量替代谷氨酸钠。鉴于食品和饮料行业对5’-核苷酸的高需求，已尝试在5’-核苷酸的商业生产中固定P1核酸酶。

近年来，核酸酶P1在核酸研究中被广泛用作分析工具。已用于：；（i） 核酸的结构研究和碱基组成分析，包括末端标记RNA的序列分析和t-RNA结构分析（Chango，2009；Hua，2007，Shimelis和Giese，2006，Katayama Fujimura，1984；Aultman，KS，1982；Furuichi，1975；Silberklang，1977），（ii）蛋白质纯化过程中核酸的去除（Zabriske，1988），（iii）DNA损伤分析（赖，2008；周等，2005；姜，2003；戈德沙尔克，2002；布津斯基，1992）。最近，核酸酶P1在涉及t-RNA依赖性氨基酸生物合成和t-RNA依赖性反式酰胺化的研究方法开发中发挥了核心作用（Sheppard等人，2008），分离大量芳香/杂环致癌物DNA加合物，如dG-C8-MeIQx和dG-C8-PhIP（Neale，2008），定量测定UVA辐射和补骨脂素等试剂在人体细胞中诱导的DNA链间交联和单加合物（Lai，2008；Cao，2008），以及测定组织DNA中的2’-脱氧核苷以研究DNA脱氨基（Kim，2006a，2006b）。

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