实时PCR基本原理

PCR或聚合酶链反应已成为世界范围内现代分子生物学的基石。实时PCR是聚合酶链反应的一种高级形式，最大限度地发挥了该技术的潜力。

为了理解实时PCR，更容易从基本PCR的原理开始：

PCR是一种扩增DNA的技术。有两个原因可以解释为什么你想要扩增DNA。首先，你可能想简单地创建一段罕见DNA的多个副本。例如，法医科学家可能想放大犯罪现场的一小片DNA。然而，更常见的情况是，您可能希望比较两个不同的样本看看哪个更丰富。DNA分析需要扩增，以便有足够的DNA提供可检测的量化信号。如果以相同的速率放大两个样本，则可以计算哪个样本的感兴趣目标拷贝数最高。

它是一种驱动PCR的耐热聚合酶。聚合酶将合成与任何单链DNA互补的碱基序列，前提是它具有双链起点。

这是非常有用的，因为你可以通过添加与你感兴趣的基因互补的小块DNA来选择你希望聚合酶在混合DNA样本中扩增的基因。这些小块DNA被称为引物，因为它们为DNA样本提供引物，为聚合酶结合做好准备，并开始复制感兴趣的基因。

在PCR过程中，温度变化用于控制聚合酶的活性和引物的结合。

为了开始反应，将温度升高到95℃。在此温度下，所有双链DNA都“融化”成单链：

然后将温度降至约60°C。这允许引物与您感兴趣的基因结合：

因此，聚合酶有结合的地方，可以开始复制DNA链：

聚合酶的最佳操作温度为72°C，因此在这一点上，温度有时会升高到72°C，以使酶更快地工作。

现在你感兴趣的基因拷贝数是你开始时的两倍：

这种温度变化在大约40个“周期”内重复。因此，一个副本变为2，2变为4，4变为8，依此类推，直到创建了数十亿个副本。

在扩增你的基因后，可以将扩增的DNA放在琼脂糖凝胶上，用染料染色，使其可见。可见光带越亮，创建的目标副本就越多。

实时PCR

实时PCR也采用了同样的扩增原理。但在反应结束时，该过程不是观察凝胶上的条带，而是“实时”监控。从字面上讲，反应被放置在实时PCR机器中，该机器使用摄像机或检测器观察反应发生。

有许多不同的技术可用于监测PCR反应的进展，但它们都有一个共同点。它们都将DNA的扩增与荧光的产生联系起来，荧光可以在每个PCR周期中用摄像机简单地检测到。因此，随着反应过程中基因拷贝数的增加，荧光也随之增加。

与传统方法相比，实时PCR有许多优点：

• 首先，它让你了解反应。你可以从字面上看到哪些反应效果良好，哪些反应失败。

• 反应效率可以精确计算。

• 反应后也无需在凝胶上运行PCR产物，因为熔融曲线分析可以有效地为您实现这一点。

• 然而，最大的优点是实时PCR数据可用于对基因表达进行真正的定量分析。相比之下，老式的PCR最多只能半定量。

介绍

在设计实时PCR实验时，一个重要的决定是为您的应用选择正确的检测化学。有两个主要选项可供选择。大多数人使用嵌入染料（如SYBR green）或基于水解探针的检测溶液（如Taqman®或PerfectProbe）。这两种技术都是为了在PCR过程中产生荧光而设计的，这使您的实时PCR机器能够“实时”监测反应。

SYBRgreen（或其他插层染料）

SYBRgreen是目前最常用的插层染料。还有其他的，但很可能SYBRgreen就是你听说过的那个。所有这些染料都通过一个简单的机制进行操作。

染料本身是荧光的，但在双链DNA存在的情况下，染料与DNA双螺旋插入（结合）。这会改变染料的结构，使其发出更多的荧光。因此，非常简单地说，随着PCR产生更多的DNA，更多的染料可以结合，产生更多的荧光。

水解探针

探针是荧光标记的DNA寡核苷酸。它们被设计成在PCR反应期间与其中一个引物的下游结合，并在反应期间发出荧光信号。探针的5’端用荧光报告分子标记。FAM是一种绿色报告器，是最常用的，但也有其他的，如VIC、JOE、CY5等，它们以不同的波长发光，可以通过单独的检测通道读取。探针3’端有一个猝灭分子。这是另一种有效地抑制报告器输出的分子。因此，当报告器和猝灭器在物理上彼此接近时，荧光输出的整体水平较低。

在PCR过程中，探针与引物下游结合。然后在反应过程中，探针被聚合酶切割。通过切割探针，报告子和猝灭子被分离，这意味着猝灭子不再对报告子产生影响，荧光水平增加。这意味着PCR的每个周期都会切割更多的探针，产生更多的荧光。

需要考虑的事项：成本

成本是任何实验设计的重要组成部分。使用水解探针比插入染料更昂贵。这意味着，如果你有一个针对许多不同基因或靶点的实验，那么你可能会想选择一种插层染料作为检测化学物质。然而，如果你只有几个感兴趣的目标，并且你知道它们将是你的重点，那么你应该选择使用水解探针。

需要考虑的事项：特殊性

水解探针：总的来说，水解探针比插入染料提供更方便的数据。这是因为其固有的特殊性。当你从水解探针获得信号时，你可以确定信号来自于你的目标序列的真实放大。只有当引物和探针在正确的位置结合到正确的靶点时，才可能获得信号。因此，不需要运行后分析来确认正确的目标已被放大。这意味着数据本身是可靠的，并且易于处理。

插层染料：插层染料的缺点是它们是非特异性的。如果你的PCR扩增出错误的靶点，甚至不止一个靶点，你仍然会得到一个看起来与真实信号相同的扩增图。插入染料将结合并报告在反应过程中形成的任何双链DNA，无论它是什么。这意味着需要额外的分析才能确定结果。该分析以“熔融曲线”（有时称为“解离曲线”）的形式进行。他们需要更多的时间和经验才能正确解读。为了处理数据，沿放大图解释熔体曲线至关重要。

需要考虑的事项：目标丰度

由于其固有的缺乏特异性，当你感兴趣的靶点很少时，嵌入染料的效果较差。当靶标罕见时，引物更有可能形成引物二聚体或与错误靶标结合。即使是最好的引物最终也会形成引物二聚体，如果没有真正的靶点，经过足够的PCR循环后也会发出错误信号。然而，当有很多你感兴趣的目标存在，然后嵌入染料工作得很好。

因此，根据经验，如果您感兴趣的靶点很少（Cq值>30），那么使用插层染料可能很麻烦，建议使用水解探针。但是，如果您感兴趣的目标是丰富的（Cq值<30），那么使用插入到期将完全足够。