本实验主要用于制备感受态E.coli TG1细胞。

操作方法

电穿孔转化感受态E.coliTG1细胞的制备

原理

主要原理就是通过处理使细胞的通透性变大，直观的说，使得细胞膜表面出现一些孔洞，便于外源基因或载体进入感受态细胞。由于细胞膜的流动性，这种孔洞会被细胞自身所修复。

材料与仪器

TG1细胞
NaCl 胰化蛋白胨 酵母提取物 去离子水 KCl NaOH 葡萄糖溶液 MgCl2 甘油
恒温旋转式摇床 三角烧瓶 离心管 低温高速离心机

步骤

一、试剂配制

SB培养基

细菌培养用胰化蛋白胨     20g

细菌培养用酵母提取物       5g

NaCl                                0.5g

去离子水                       950ml

250mmol/L KCl溶液         10ml

二、操作步骤

1. 从新鲜的LB平板培养物中挑选一个TG1克隆，接种于10ml SB培养基中。

2. 37℃摇床培养过夜。

3. 取2.5ml培养物转接于0.5L SB中，另添加10ml 20%葡萄糖和5ml 1mol/L MgCl2。

4. 37℃培养直到OD600=0.7～0.8。

5. 将培养物置于冰浴15min，然后4000r/min于4℃离心20min，弃上清。

6. 将菌体重悬于1/2体积的预冷10%甘油中，4000r/min于4℃离心20min，弃上清。

7. 重复第（6）步骤。

8. 将菌体重悬于15ml 10%甘油，并转移至一支50ml的离心管中。3500r/min于4℃离心15min。小心地去掉上清，得到4～5ml细菌。迅速地将其吹打重悬；

9. 分装成200μl或40μl 的小份，操作应在乙醇/干冰浴中进行。贮存于-70℃。

10. 用pUC19质粒测试制备感受态细菌的转化效率，应达到109cfu/μg DNA。

注意事项

1. 挑选低代数的菌种是关键，千万不要每次活化后保存活化后的菌种，更不要将菌种长期保存在-20度。

2. 大肠杆菌在平板上过夜生长后，可置冰箱中保存一个月左右；接种新鲜的菌落或菌液有利于细菌细胞的同步快速生长，从而使细菌群体在达到一定的OD值后（0.375）大部分细胞都处于感受态。

3. 大肠杆菌的生长需要氧气，剧烈振荡的目的是提高培养基的溶氧量以利于细菌的生长。

4. 达到细菌对数生长早、中期，需时约2.0~2.5小时，此步骤至为关键，若超过此阶段，则转化效率急剧下降。

5. 低温操作的目的是使细胞不再生长，保持其感受态。

6. 洗涤细胞时细胞较脆弱，悬浮沉淀时动作要轻，可用移液枪轻轻吸打。

7. -80℃冰箱储存的感受态细胞在6-8周后，转化率很快降低。可用一已知标准及浓度的闭环质粒如pUC18/19鉴定感受态细胞的转化能力。

常见问题

来源《工业微生物实验技术手册》

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