产品描述 

应⽤：⽤于⽤普鲁卡因胺 (PROC) 标记游离聚糖。

描述：该试剂盒包含通过还原胺化反应将染料与聚糖的游离还原端缀合的试剂。

染料特性：⽆质量染料 = 235.33。

                    荧光， λex = 310 nm， λem = 370 nm。

样品数量每组标记试剂 12 个单独的分析样品（共 24 个样品⽤于成套工具）

每个样品的样品量从 25 pmol 到 25 nmol 聚糖。

合适的样品可以标记任何带有游离还原末端的纯化聚糖。

结构完整性唾液酸、岩藻糖、硫酸盐或磷酸盐没有可检测到（< 2 摩尔%）的损失。

标记选择性本质上是化学计量标记。

贮存：在室温下避光保存。远离热源、光源和湿⽓。所提供的试剂⾄少可稳定保存两年。

船运：该产品可以在环境温度下运输。

处理：确保使⽤的任何玻璃、塑料制品或溶剂不含糖苷酶和环境碳⽔化合物。在所有样品处理程序中使⽤⽆粉⼿套，并避免被环境碳⽔化合物污染。

安全：仅供研究使⽤。不⽤于⼈类或药物使⽤

套件内容 

每个试剂盒包含两个标记反应组。每个标记反应组由以下各⼀个⼩瓶组成：

需要额外的试剂和设备 

• 纯净⽔

• 加热块、烤箱或类似的⼲式加热器（不能使⽤⽔浴）设置为 65°C

• 离⼼蒸发器（例如 Savant、Heto 或类似产品）

• 反应瓶（例如聚丙烯微量离⼼瓶）

• 注意：如果进行可选的标记后样品清理，则需要更多消耗品（请参阅样品清理部分）

标签的时间线 

标注⽅法

1 纯化聚糖       

在标记聚糖之前，最好从样品中去除⾮碳⽔化合物污染物，例如蛋⽩质/肽材料、盐和去污剂。这可以使⽤ EB10 滤芯来实现或蛋⽩结合膜。使⽤CEX ⼩柱可实现 O-聚糖的净化。

2 将样品转移到反应瓶中

该试剂盒设计⽤于每次反应最多标记 25 nmol 的聚糖。使⽤单⼀的纯聚糖，每个反应低⾄ 5 pmoles 可以在随后的 HPLC 和MS 分析中被标记和检测。

合适的反应瓶包括⼩型聚丙烯微量离⼼瓶、PCR ⼯作瓶或 96如果进行更⾼通量的样品分析，请使⽤ PCR 板。

3 ⼲燥样品并重新溶解在 10 µL ⽔中

• 如果样品体积超过 10 µL，请⼲燥样品。 

• 如果样品需要⼲燥，则应使⽤离⼼蒸发器进行⼲燥。

如果⽆法做到这⼀点，则可以谨慎使⽤冷冻⼲燥（冻⼲）（特别是确保样品在⼩瓶底部⼲燥成⼩⽽致密的物质）。不要将样品置于⾼温(>28°C) 或极端 pH 条件下，因为这些条件可能导致唾液酸的酸催化损失（⾼温、低 pH）或聚糖还原末端差向异构化（在⾼ pH 条件下）。

样品⼲燥后，加⼊10 µL ⽔重新溶解聚糖。

4.准备染料溶液

将 150 µl 试剂盒组分 LT-ACETIC-DMSO-01（30% ⼄酸的 DMSO 溶液）添加到⼀⼩瓶普鲁卡因胺染料中，并通过移液器操作混合直⾄染料溶解。有时需要加热（30-60°C）来帮助溶解染料。

将 150 µL 溶解的染料溶液转移到⼀瓶还原剂中，并通过移液器进行混合，直到还原剂溶解。有时需要加热（30-60°C）来帮助

5 向样品中添加标记试剂

向每个聚糖样品中加⼊ 10 µl 标记试剂，盖上⼩瓶或 PCR 板，彻底混合并短暂离⼼（5-10 秒）以确保标记溶液位于⼩瓶底部。

6 孵化

将反应瓶放⼊设置为 65°C 的烘箱或加热块中并孵育 1 ⼩时。我们建议在孵化步骤中使⽤烤箱。烤箱为您提供全⽅位的热量反应瓶。

样品必须完全溶解在标记溶液中才能有效标记。溶解开始孵育 15 分钟后，样品可以涡旋振荡，然后继续。

7 冷却和离⼼

孵育期结束后，将样品从烘箱或加热块中取出，让它们冷却⾄室温，然后短暂离⼼反应瓶以确保样品在⼩瓶底部⽽不是盖⼦中。

标记后样品净化

对于⼤多数应⽤，我们建议您在通过 HPLC、MS 或 LC-MS 分析之前执行标记后样品净化以去除⾮聚糖材料，例如过量的染料和其他标记试剂。

贴标后清理的好处

• 去除可能⼲扰HPLC 和LC-MS 样品分析的游离染料和化学物质。

• 延⻓ HPLC ⾊谱柱的使⽤寿命。

• 更⼩的聚糖，例如接近 HPLC 梯度起点的 O-link 将被检测到，⽽⽆需游离染料的⼲扰。

• 可以使⽤全系列的 HPLC ⾊谱柱。

• HPLC ⾊谱柱的样品容量问题不太可能发⽣。

普鲁卡因酰胺标记的聚糖分析

普鲁卡因酰胺标记的聚糖可以通过多种不同的分析⽅法进行研究，包括 (U)HPLC、ESI 质谱和 LC-ESI-MS。

⽰例 UHPLC 条件 ‒ 条件因仪器⽽异。检查这些条件是否适合你的设备。

• 样品在与起始梯度相当的溶剂中配制，例如 76% ⼄腈。

• ⾊谱柱：Waters BEH Glycan ⾊谱柱 15 cm x 2.1 mm。

• 柱温：40°C

• 荧光检测器设置：激发波⻓：310 nm，发射波⻓：370 nm。

• 溶剂 A：50 mM 甲酸铵缓冲液 pH 4.4

• 溶剂 B：⼄腈

糖谱未知样品的⻓ UHPLC 梯度并且聚糖可能很⼤和/或⾼度唾液酸化。

该 UHPLC 梯度已被证明可⽤于分离从⼈ IgG 和促红细胞⽣成素中释放的 N-聚糖，然后进行普鲁卡因胺标记和净化 。⼀旦确定了样品中存在的聚糖范围，就可以优化 UHPLC 梯度并显着缩短（在某些 UHPLC 仪器上缩短⾄ 15 分钟）。

对普鲁卡因酰胺标记的 N-聚糖进行 LC-MS 分析，⽤⼾可以同时获得分离的 N-聚糖的荧光⾊谱图和 ESI-MS 光谱，它们可以结合起来提供更⼤的整体存在的 N-聚糖结构的图⽚。 MS 数据可⽤于将 m/z 质量分配给荧光⾊谱图中的每个峰，从⽽以单糖组合物的形式为每个峰提供可能的结构标识。通过 ESI-MS 分析，可以确定荧光⾊谱图中的单峰具有多个聚糖结构。

从⼈ IgG 聚糖释放的 N-聚糖的普鲁卡因酰胺标记和纯化程序的重复性（精密度）显⽰低 RSD 值（对于相对 % ⾯积 >0.7 % 的峰，RSD <5%）。

净化后的普鲁卡因胺标记的⼈ IgG 聚糖有关此⾊谱图中每个峰的结构注释

净化后的普鲁卡因胺标记的促红细胞⽣成素聚糖

⽰例 ESI-MS 光谱

普鲁卡因胺标记的⼈ IgG 聚糖。⼤约 10 pmol 的聚糖注⼊ LC-MS 系统。⼀个样本，所有数据相加。质谱在 Bruker AmaZon Speed ETD 仪器上以正离⼦设置运行。

普鲁卡因胺标记的 IgG 聚糖峰的⽰例 ESI-MS 光谱

峰是 Hex5HexNAc2 聚糖：727.93 [M+H]2+ (MAN5) 和 Hex3HexNAc4dHex1 聚糖：943.52 [M+H]2+ 和 629.35 [M+H]3+ (FA2B) 的混合物。插图显⽰了基峰⾊谱图（顶部曲线）和荧光

⾊谱图（底部迹线）。箭头表⽰ MS 光谱的来源。

 ⼈ IgG 中主要普鲁卡因胺标记的 N-聚糖的结构分配

通过 LC-MS 分析普鲁卡因胺标记的 N-聚糖，⽤⼾可以指定暂定的聚糖结构到他们样本中的峰值。

 每个峰的相对 % 峰⾯积、GU 值数据和 m/z 值。通过 LC-MS 分析普鲁卡因胺标记的 N-聚糖，⽤⼾可以指定暂定的聚糖结构

 标记重复性（精度）。净化后普鲁卡因胺标记的⼈ IgG 聚糖。⽐较了⼗⼆个独⽴的聚糖释放和标记样品。归⼀化⾊谱图

样品的相对 % 峰⾯积⽐较。普鲁卡因酰胺标记和纯化程序的重复性（精密度），⽤于⼈体释放的 N-聚糖。IgG 聚糖的 RSD 值较低（相对 % ⾯积 >0.7 % 的峰的 RSD <5%）

还原胺化反应

1. 席夫碱基阵型

这需要具有⾃由还原末端的聚糖，该末端在闭环（环状）和开环（⽆环）形式之间达到平衡。染料的伯氨基对⽆环还原末端残基的羰基碳进行亲核攻击，形成部分稳定的 Schiff

2. 减少席夫碱

席夫碱基亚胺基团被化学还原以产⽣稳定的标记聚糖

通过还原胺化⽤普鲁卡因胺 (PROC) 标记聚糖。

参考文献

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2. Klapoetke S, Zhang J, Becht S, Gu X, Ding X. Evaluation of a new method for the analysis and identification of procainamide-tagged N-linked glycans by HPLC with fluorescence and mass spectrometry detection. J Pharm Biomedical Anal. 2010;53(3):315-24. doi: 10.1016/j.jpba.2010.03.045.

3. . Pabst M, Kolarich D, Pöltl G, Dalik T, Lubec G, Hofinger A, Altmann F. Comparison of fluorescent labeling of oligosaccharides and introduction of new post-labeling purification methods. Anal biochemistry. 2009;384(2):263-73. doi: 10.1016/j.ab.2008.09.041.

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