产品描述

应用:用于用普鲁卡因胺 (PROC) 标记游离聚糖。

描述:该试剂盒包含通过还原胺化反应将染料与聚糖的游离还原端缀合的试剂。

染料特性:无质量染料 = 235.33。

                  荧光， ex = 310 nm， em = 370 nm。

样品数量每组标记试剂 96 个单独的分析样品

每个样品的样品量从 25 pmol 到 25 nmol 聚糖。

合适的样品可以标记任何带有游离还原末端的纯化聚糖。

结构完整性唾液酸、岩藻糖、硫酸盐或磷酸盐没有可检测到（< 2 摩尔%）的损失。

标记选择性本质上是化学计量标记。

贮存：在室温下避光保存。远离热源、光源和湿气。所提供的试剂至少可稳定保存两年。

船运：该产品可以在环境温度下运输。

处理：确保使用的任何玻璃、塑料制品或溶剂不含糖苷酶和环境碳水化合物。在所有样品处理程序中使用无粉手套，并避免被环境碳水化合物污染。所有涉及标记试剂的步骤都必须在干燥的环境中使用干燥的玻璃器皿和塑料器皿进行。一旦单独的试剂瓶打开，其内容物应立即使用，过量的然后根据当地安全规则丢弃。

安全：仅供研究使用。不用于人类或药物使用

套件内容

需要额外的试剂和设备

• 纯净水

• 加热块、烤箱或类似的干式加热器（不能使用水浴）设置为 65°C

• 离心蒸发器（例如 Savant、Heto 或类似产品）

• 反应瓶（例如聚丙烯微量离心瓶）

• 注意：如果进行可选的标记后样品清理，则需要更多消耗品（请参阅样品清理部分）

标签的时间线

标记过程需要 2.5 小时，而实际标记孵育仅需 1小时。

标注方法

1 纯化聚糖

在标记聚糖之前，最好从样品中去除非碳水化合物污染物，例如蛋白质/肽材料、盐和去污剂。这可以使用 EB10 滤芯来实现或蛋白结合膜。使用 CEX 小柱可实现 O‑聚糖的净化。

2 将样品转移到反应瓶或 PCR 板

该试剂盒设计用于每次反应最多标记 25 nmol 的聚糖。使用单一的纯聚糖，每个反应低至 5 pmoles 可以在随后的 HPLC 和MS 分析中被标记和检测。

合适的反应瓶包括小型聚丙烯微量离心瓶、PCR 工作瓶或 96 如果进行更高通量的样品分析，请使用 PCR 板。

3干燥样品

样品的干燥应使用离心蒸发器进行。如果无法做到这一点，则可以谨慎使用冷冻干燥（冻干）（特别是确保样品在小瓶底部干燥成小而致密的物质）。不要将样品置于高温 (>28°C) 或极端 pH 条件下，因为这些条件可能导致唾液酸的酸催化损失（高温、低 pH）或聚糖还原末端差向异构化（在高 pH 条件下）。

4准备染料溶液

• 将 1.2 mL 试剂盒组分 LT‑ACETIC‑DMSO 96（30% 乙酸的 DMSO 溶液）添加到普鲁卡因胺染料瓶中，盖上盖子并摇晃和涡旋直到染料溶解。

• 向溶解的染料溶液中加入1.2 mL 水，盖上盖子并摇晃和涡旋。

• 将 2.4 mL 溶解的染料溶液转移到一瓶还原剂中，盖上盖子并摇晃和涡旋直到还原剂完全溶解。

5向样品中添加标记试剂

向每个糖链样品中加入 20 µL 标记试剂，盖上小瓶或 PCR 板，彻底混合并短暂离心（5‑10 秒）以确保标记溶液位于小瓶底部。

6孵化

将反应瓶放入烤箱或加热块设置在 65°C 并孵育 1 小时。我们建议在孵化步骤中使用烤箱。烘箱为反应瓶提供全方位的热量。

样品必须完全溶解在标记溶液中才能有效标记。鼓励完成溶解 开始孵育 15 分钟后，样品可以涡旋振荡，然后继续。

7. 冷却和离心

 孵育期结束后，将样品从烘箱或加热块中取出，让它们冷却至室温，然后短暂离心反应瓶以确保样品位于瓶底而不是盖子中。

标记后样品净化

对于大多数应用，我们建议您在通过 HPLC、MS 或 LC‑MS 分析之前执行标记后样品净化以去除非聚糖材料，例如过量的染料和其他标记试剂。

贴标后清理的好处

• 去除可能干扰HPLC 和LC‑MS 样品分析的游离染料和化学物质。

• 延长 HPLC 色谱柱的使用寿命。

• 更小的聚糖，例如接近 HPLC 梯度起点的 O‑link 将被检测到，而无需游离染料的干扰。

• 可以使用全系列的 HPLC 色谱柱。

• HPLC 色谱柱的样品容量问题不太可能发生。

使用 S 小柱或 Procainamide Clean‑up Plate可以实现对普鲁卡因胺 (PROC) 标记的 N‑聚糖的标记后样品净化，如果执行更高通量样品分析。

可以使用S 小柱对 PROC 标记的 O‑聚糖进行标记后样品净化。

普鲁卡因酰胺标记的聚糖分析

普鲁卡因酰胺标记的聚糖可以通过多种不同的分析方法进行研究，包括 (U)HPLC、ESI 质谱和 LC‑ESI‑MS。

示例 UHPLC 条件 – 条件因仪器而异。检查这些条件是否适合你的设备。

• 样品在与起始梯度相当的溶剂中配制，例如 76% 乙腈。

• 色谱柱：Waters BEH Glycan 色谱柱 15 cm x 2.1 mm。

• 柱温：40°C

• 荧光检测器设置：激发波长：310 nm，发射波长：370 nm。

• 溶剂 A：50 mM 甲酸铵缓冲液 pH 4.4（Ludger 产品：LS‑N‑BUFFX40）

• 溶剂 B：乙腈

糖谱未知样品的长 UHPLC 梯度并且聚糖可能很大和/或高度唾液酸化

证明使用这种 UHPLC 梯度可分离从人 IgG 和促红细胞生成素释放的 N‑聚糖，然后进行普鲁卡因胺标记和净化。一旦确定了样品中存在的聚糖范围，就可以优化 UHPLC 梯度并显着缩短（在某些 UHPLC 仪器上缩短至 15 分钟）。

对普鲁卡因胺标记的 N‑糖链进行 LC‑MS 分析，用户可以获得分离的 N‑糖链的荧光色谱图和 ESI‑MS 光谱，可以将它们组合起来以更全面 地了解 N‑糖链结构当下。 MS 数据可用于将 m/z 质量分配给荧光色谱图中的每个峰，从而以单糖组合物的形式为每个峰提供可能的结构同一性。通过 ESI‑MS 分析，可以确定荧光色谱图中的单峰具有多个聚糖结构。

 净化后的普鲁卡因胺标记的人 IgG 聚糖

 净化后的普鲁卡因胺标记的促红细胞生成素聚糖

还原胺化反应

1. 席夫碱基阵型

这需要具有自由还原末端的聚糖，该末端在闭环（环状）和开环（无环）形式之间达到平衡。染料的伯氨基对无环还原    末端残基的羰基碳进行亲核攻击，形成部分稳定的席夫碱。

2. 减少席夫碱。

席夫碱基亚胺基团被化学还原以产生稳定的标记聚糖。

 通过还原胺化用普鲁卡因胺 (PROC) 标记聚糖

参考文献

1.Kozak RP, Tortosa CB, Fernandez DL, Spencer DI. Comparison of procainamide and 2-aminobenzamide labeling for the analysis and identification of glycans by fluorescence detection by liquid chromatography coupled to electrospray ionization mass spectrometry. Anal biochemistry. 2015;486:38‑40. doi: 10.1016/j.ab.2015.06.006.

2. Klapoetke S, Zhang J, Becht S, Gu X, Ding X. Evaluation of a new method for the analysis and identification of procainamide-tagged N-linked glycans by HPLC with fluorescence and mass spectrometry detection. J Pharm Biomedical Anal. 2010;53(3):315‑24. doi: 10.1016/j.jpba.2010.03.045.

3.Pabst M, Kolarich D, Pöltl G, Dalik T, Lubec G, Hofinger A, Altmann F. Comparison of fluorescent labeling of oligosaccharides and introduction of new post-labeling purification methods. Anal biochemistry. 2009;384(2):263‑73. doi: 10.1016/j.ab.2008.09.041.

4. Liu R, Giddens J, McClung CM, Magnelli PE, Wang LX, Guthrie EP. Evaluation of glycoengineered monoclonal antibodies by LC‑MS analysis combined with multiple enzymatic digestions. Monoclonal antibodies. 2016;8(2):340‑6. doi: 10.1080/19420862.2015.1113361.

阿拉丁：https://www.aladdin-e.com