小分子活性肽作为疫苗、诊断试剂、药物以及药物先导化合物，已成为药物研究领域的新趋势。小分子活性肽有多种筛选方法：基于噬菌体展示肽库、随机合成多肽库、反义多肽库、蛋白质降解产物（酶解、化学裂解）、MHC-多肽复合物、以及基于蛋白质结构/结构预测等。

多肽筛选方法概览

噬菌体展示肽库筛选是较成熟的筛选方法。通常经约3轮筛选可获得较理想的噬菌体克隆，通过测序即可确定所展示的肽序列，再通过定向合成验证其生物活性。其不足在于库的多样性易受多种因素影响，且初筛所得肽的亲和力往往有限，需进一步优化。

随机合成肽库可根据需求定制，通常生产周期短、库容大。以长度为10个氨基酸的肽库为例，其理论多样性为20^10≈1×10^13；但实际可实现的有效库容受合成与筛选方式限制。常见有两种合成策略：

• 分开再混合（split-and-mix）：所得肽库不同序列含量更趋一致，且每个树脂球通常仅含一种多肽。
• 与氨基酸预混合（pre-mix）。不同序列含量差异较大，可能导致代表性偏差，从而影响筛选效果。由于库容庞大，对筛选到的活性多肽进行结构鉴定具有相当挑战性。

反义肽库筛选属于按生物学原理设计的定向肽库，针对性强，但需要先确定目标蛋白关键区域的氨基酸序列。通常可用Clustal X等生物信息学软件进行比对分析以确定关键区域序列。序列确定后，可依据Mekler–Idlis（M-I）理论设计反义肽库；既可直接合成进行筛选，也可借助软件（如Discovery Studio）进行模拟筛选以获得容量更小的候选库。此类方法因目标明确且库容较小（以10肽为例，约为2^10≈10^3），更易获得目标多肽并完成结构确认。

筛选到目标多肽后，可通过构建不同的多肽文库来确认功能区域，并进一步筛选活性更强的多肽。

序列优化方法概览

对于已获得的多肽序列，可采用单位点扫描或多位点随机扫描等文库设计对序列进行优化，以获得活性更强的变体。

• 单位点扫描的设计较为直接：在选定的区域或位点依次以其他氨基酸替换，有助于发现对活性或特性影响显著的关键位点。
• 多位点扫描随机多肽文库相对复杂：以20种天然氨基酸通过“鸟枪式”（shotgun）方式同时、随机取代选定残基，在被选择的位点尽可能构建多种突变组合，从而筛选出活性增强的序列。此类文库库容与筛选工作量较大，例如对三个位点同时变异，理论组合即为20^3=8000。采用PeptideGo™专有组合化学策略，可显著减少合成数量与筛选工作量；以三位点筛选为例，实际需要的合成与筛选规模可降至约800条（取决于设定的氨基酸集合），也使更多位点的同时扫描成为可能。

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