1.实验器材

• 垂直电泳系统：电源、电泳槽及配套附件。
• 制胶组件：厚板（spacer plate，0.75/1.0/1.5 mm）、薄板（short plate）与塑料框架。
• 加样与移液：微量移液器及吸头（5 mL、1 mL、200 μL、10 μL）。
• 离心与储存耗材：离心管（1.5 mL、15 mL、50 mL）；棕色离心管（用于分装TEMED）。
• 玻璃器皿：烧杯、容量瓶（100 mL）、量筒（100 mL、500 mL、1000 mL）、玻璃棒。
• 试剂容器：广口试剂瓶（500 mL、1000 mL）、棕色瓶（250 mL、500 mL）。
• 实验耗材：滤纸、无尘擦拭纸、保鲜膜/密封袋。
• 计量与监测：pH计等。

2.实验试剂

• 30%丙烯酰胺/亚甲基双丙烯酰胺混合液（Acr-Bis）

配制方法（100mL）：

①于100 mL烧杯称取丙烯酰胺（Acr）29.2 g与N,N′-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）0.8 g；

②加入超纯水50 mL（温水有利溶解），磁力搅拌至完全溶解；

③转入100 mL容量瓶，以蒸馏水定容至100.0 mL；

④以中速滤纸过滤，4℃保存（避光为宜）。

注意：

①储存与稳定性

• ​丙烯酰胺在光照与碱性条件下可缓慢脱氨生成丙烯酸/双丙烯酸，影响胶性能。配制后确认溶液pH≤7.0，于4℃避光保存，建议保存期≤2个月。
• 若出现不溶物（试剂杂质或贮存导致），过滤后再分装储存。

②试剂纯度与电泳表现

• 丙烯酰胺纯度直接影响分离效果与背景噪声，建议选用电泳级丙烯酰胺与交联剂（Bis）。

③凝胶形成机理（概要）

• 丙烯酰胺单体经自由基引发聚合为长链；在N,N′-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）存在下形成交联网络。
• 凝胶孔径取决于聚合过程中链长与交联度：单体/交联剂比例、总体浓度与反应条件（引发剂、催化剂、温度、pH）共同决定分离范围与分辨率。

1.5mol/L Tris-HCl（pH8.8）

配制方法（100mL）：

①称取18.17 g Tris于100 mL烧杯；

②加入蒸馏水80 mL，磁力搅拌至完全溶解；

③以6 mol/L盐酸逐滴调至pH8.8（实时监测pH）；

④转入100 mL容量瓶，以蒸馏水定容至100.0 mL；4℃贮存（可选：过滤后分装密封）。

1.0mol/L Tris-HCl（pH6.8）

配制方法（100mL）：

①称取12.11 g Tris于100 mL烧杯；

②加入蒸馏水80 mL，磁力搅拌至完全溶解；

③以6 mol/L盐酸逐滴调至pH6.8（实时监测pH）；

④转入100 mL容量瓶，以蒸馏水定容至100.0 mL；4℃贮存（可选：过滤后分装密封）。

10%十二烷基硫酸钠（SDS）

配制方法（100mL）：

①称取十二烷基硫酸钠（SDS）10.00 g于100 mL玻璃烧杯（或250 mL试剂瓶）。

②加入超纯水约80–90 mL，磁力搅拌/涡旋至完全溶解。

③转入100 mL容量瓶，以超纯水定容至100.0 mL，轻摇混匀。

④室温保存；若长期存放可置4℃避光。出现结晶时可于约37℃温和加热复溶。

注意：

①低温析晶与复溶：SDS溶液在低温下易结晶；使用前应经温浴（如37–50℃）至晶体完全溶解，避免因未复溶导致实际浓度偏低。

②配制与贮存建议：避免一次性大量配制长期存放；按用量小批量现配或短期保存，以确保浓度与性能稳定。

10%过硫酸铵（APS）

配制方法（10mL）：

①称取过硫酸铵（APS）1.00 g于15 mL离心管；

②加入超纯水至约8–9 mL，振荡溶解后定容至10.0 mL；

③按1.0 mL/管分装于1.5 mL离心管，避光，-20℃冻存。

注意：

①过硫酸铵（APS）固体开封后易吸湿潮解并失活，优先选择小包装采购，减少反复开启暴露。

②小包装开启后一次性配制母液，随后按0.5 mL/管分装于1.5 mL微量离心管，避光、-20℃长期冻存。

③取用时单管解冻即用，避免反复冻融；剩余溶液不回灌母瓶以防污染与活性下降。

四甲基乙二胺（TEMED）

电泳缓冲液（10×Tris Glycine SDS Running Buffer，10×TGS）

配制方法（1000mL）：

①称取Tris 30.28 g、甘氨酸144.13 g于1000 mL烧杯。

②加入蒸馏水800 mL，磁力搅拌至完全溶解。

③转入1000 mL试剂瓶（或先入量筒定容后回灌），以蒸馏水定容至1000.0 mL；室温密封保存，建议使用期约1个月。

④使用时按需取用，以蒸馏水10倍稀释至工作浓度（1×）。

注意：

配制母液后应核验pH，目标值约8.3。若偏差>0.5pH单位，在调整前优先检查实验用水的pH、试剂纯度与贮存状态等潜在原因；确认无误后再行微量校正。

各浓度分离胶及浓缩胶配方表

Separation Gel — 6%

Separation Gel — 8%

Separation Gel — 10%

Separation Gel — 12%

Separation Gel — 15%

Loading Gel（5%）

上样缓冲液（Laemmli Loading Buffer）

非还原样品缓冲液配方（5×）：

配制方法（100mL）:

①称取SDS 10.00 g与溴酚蓝10 mg于烧杯；

②加入1 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）25 mL，搅拌至完全溶解；

③加入甘油50 mL，混匀；

④转入100 mL容量瓶，以超纯水定容至100.0 mL；

⑤分装于1.5 mL离心管，-20℃贮存（使用前充分复溶）。

还原样品缓冲液配方（5×）：

非还原样品缓冲液+500mM DTT

配制方法（1mL）:

称取DTT 154mg，加入ddH₂O至1mL，-20℃贮存。

注意：

①还原剂选择与作用：在SDS存在下，常用β-巯基乙醇（2–5%，v/v）或二硫苏糖醇（DTT，50–100 mM，终浓度）断裂蛋白质二硫键，促进完全变性。基于β-巯基乙醇具强烈刺激性气味与挥发性，本规程采用DTT作为标准还原剂。

②加入时机：上样前现加于样品与上样缓冲液的混合体系中（混匀后可按需加热变性），以确保还原活性充足。

③终浓度定义：所列浓度为样品与缓冲液混合后（1×工作液）体系内各组分的最终浓度。

④配置与贮存：5×上样缓冲液可室温保存；使用时按比例稀释至1×并现加入DTT（勿长期预混），以避免还原剂失活。

蒸馏水（dH2O），超纯水（ddH2O）或及超纯水（UP）

3.聚丙烯酰胺凝胶的配制

（1）凝胶模具准备

①按实验需求选择电泳玻璃板厚度。

②先以洗涤剂清洗玻板并晾干；再用75%（v/v）乙醇擦拭、蒸馏水冲洗，晾干。

③使用前以无尘擦拭纸再次拭净。

④按说明将厚板（spacer plate）与薄板（short plate）装配并固定于灌胶器，检查密封与夹持均匀性。

（2）分离胶灌制

①于50 mL离心管依次加入：蒸馏水、30% Acr–Bis、1.5 mol/L Tris-HCl（pH 8.8）、10% SDS，轻柔混匀。

②加入新鲜配制的10%APS与TEMED，迅速混匀。

③以5 mL移液器沿玻板内侧缓慢灌注分离胶：液面至短玻板顶端下约1.5 cm（6×8 cm、1.5 mm厚玻板常用体积约3.75 mL）。

④轻覆约1 cm蒸馏水（灌满玻板）以整平液面并隔绝空气。

⑤室温静置20–40 min，待与上层水形成清晰界面即视为聚合完成；弃去上层水，倾斜以滤纸吸尽残留水分。

（3）浓缩胶灌制

①于50 mL离心管依次加入：蒸馏水、30% Acr–Bis、1.0 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）、10% SDS，轻摇混匀。

②加入新鲜10%APS与TEMED，立即混匀。

③沿玻板内侧缓慢灌注至接近玻板顶端；垂直插入梳子形成上样孔，静置10–20 min聚合。

④凝固后可在半小时内立即使用；或连板置自封袋密封，4℃保存（袋内可加少量蒸馏水维持湿度）。

⑤使用时将胶连同玻板放入电泳槽，加入电泳缓冲液后小心拔除梳子，准备上样电泳。

（4）操作提示

①配制mini胶可选15 mL/50 mL离心管作容器，旋转摇匀或移液器吹打混匀；大体积建议用适当容量烧杯并以玻棒搅拌。

②全程尽量避免产生气泡；若出现微泡，可用移液枪尖沿壁缓慢上升赶出。

4.蛋白电泳

（1）样品准备

①预热水浴锅或干式金属浴至70–100℃。

②将所需量蛋白样品转入1.5 mL微量离心管，按顺序编号并记录。

③按比例加入上样缓冲液；若采用Laemmli 5× loading buffer，以样品:缓冲液=1:4（v/v）配制（按需选择还原/非还原体系）。

④水浴/金属浴加热5 min。

⑤取出冷却至室温，瞬时离心10–30 s收集液体。

⑥按编号整理，备用上样。

（2）电泳

①将凝胶（上样孔向上）装入电泳槽；向外槽与内槽分别加入电泳缓冲液：外槽液面覆盖电极/铂丝，内槽加至完全淹没上样孔。

②垂直、缓慢拔出梳子；上样前以移液器吸取少量缓冲液对各孔轻吸排，去除残胶与气泡。

③用微量移液器按既定顺序加样并记录。

④设定120 V恒压运行；当溴酚蓝前沿到达胶底部时停止，或依据目标条带分离需要适当调整时间。

（3）操作提示

①建议使用凝胶上样专用吸头，避免接触孔底并防止溢入相邻孔；控制上样量，防止过载导致条带变形。

②吸头尖端不宜悬得过高，避免样品在缓冲液中弥散；上样操作应连续完成，减少先加样孔中样品的滞留时间。

参考文献

1. M.R.格林，J.萨姆布鲁克. 分子克隆实验指南（第四版），第十九章，方案 8 蛋白质的 SDS-PAGE.

2. Laemmli U K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of

Bacteriophage T4. Nature, 1970, 277(7): 680-685.

3. Davis B. Disc electrophoresis. II. Method and application to human serum proteins. Ann

NY Acad Sci, 1964, 121: 404-427.

4. Ornstein L. Disc Electrophoresis-I Background and Theory. Ann N Y Acad Sci. 1964,121:321-349.

阿拉丁：https://www.aladdin-e.com/