背景

Western Blot是一种使用抗体在含有大量蛋白质和其他成分的溶液中特异性识别选定抗原的技术，依赖于根据分子量和抗体-抗原识别的特异性将特定抗原与其他物质分离。Western Blot依赖于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）的标准方法。通常，SDS-PAGE是在扁平微凝胶中进行的，根据是否存在二硫键断裂试剂（如β-巯基乙醇或二硫苏糖醇），使用还原或非还原缓冲液。

直接免疫印迹法适用于已经与检测系统结合的一级抗体。直接免疫印迹法的优点在于该方法快速，因为只使用一种抗体。二级抗体的任何交叉反应也被消除。这种方法的缺点是1）一级抗体的亲和力可能会因结合而降低，2）信号放大很少。间接Western Blot是更常用的应用。该方法的优点是：1）保留了一级抗体的反应性，2）提供了多种二级抗原结合，3）通过二级抗体的多次结合提高了灵敏度。

间接Western Blot需要携带选择的共轭物的二级抗体进行检测。间接Western Blot的缺点包括二级抗体和其他蛋白质之间的交叉反应可以导致高背景信号，并且额外的步骤需要额外的时间。

直接免疫印迹法

材料

• 转移缓冲液：25mM Tris碱，0.2M甘氨酸，20%甲醇，pH 8.5。

• 十二烷基硫酸钠样品缓冲液（1X）：62.5mM Tris-HCl，室温下pH 6.8，2%十二烷基硫酸钠，10%甘油，50mM DTT，0.01%溴酚蓝或酚红。

• 10X TBS：制备1升10X TBS:24.2g Tris碱，80g氯化钠。用盐酸将pH值调节至7.6。在1X时使用。

• 封闭缓冲液：1X TBS，0.1%吐温-20，5%脱脂奶粉。对于150ml，向135ml水中加入15ml 10X TBS，混合。加入7.5g脱脂奶粉，搅拌均匀。搅拌时，添加0.15ml吐温-20（100%）。

• 洗涤缓冲液TBS/T:1X TBS，0.1%吐温-20

样品制备和分离

1.将约20ug样品在SDS样品缓冲液中煮沸5分钟，并在SDS-PAGE上溶解（12-15%）。

2.将蛋白质转移到硝化纤维素中。用水清洗吸干的硝化纤维素两次。

阻塞步骤

3.在室温下用5%脱脂奶粉在Tris缓冲盐水吐温（TBS-T）中封闭膜1小时，在室温下持续搅拌20分钟。

4.在TBS-T中清洗3次。

一级抗体培养

5.在RT下将膜与一级抗体（在封闭缓冲液中稀释）孵育2小时或在4°C下过夜。

6.在TBS-T中清洗3次。

颜色显影

7.使用增强化学发光检测方法进行检测。

间接免疫印迹法

材料

• 转移缓冲液：25mM Tris碱，0.2M甘氨酸，20%甲醇，pH 8.5。

• SDS样品缓冲液：62.5mM Tris-HCl，RT时pH 6.8，2%SDS，10%甘油，50mM DTT，0.01%溴酚蓝或酚红。

• 封闭缓冲液：1X TBS，0.1%吐温-20，5%脱脂奶粉。

• 洗涤缓冲液TBS/T:1X TBS，0.1%吐温-20

• 对于二级抗体，选择针对一级抗体同型的产品（抗小鼠IgG1、抗兔IgM、抗鸡IgY等）；根据需要共轭。

样品制备和分离

1.将约20ug样品在SDS样品缓冲液中煮沸5分钟，并在SDS-PAGE上溶解（12-15%）。

2.将蛋白质转移到硝化纤维素中。用水清洗吸干的硝化纤维素两次。

阻塞步骤

3.在室温下用5%脱脂奶粉在Tris缓冲盐水吐温（TBS-T）中封闭膜1小时，并在室温下持续搅拌1小时。

4.在TBS-T中清洗3次。

一级抗体培养

5.在RT下将带有一级抗体（在封闭缓冲液中稀释）的膜培养2小时或在4°C下过夜。

6.在TBS-T中清洗膜3次。

二级抗体培养

7.用1%脱脂奶粉稀释TBS-T中的二级抗体，并在室温下培养1小时。

8.在TBS-T中清洗3次，每次5分钟。

颜色显影

9.使用增强化学发光检测方法进行检测。