1.目的

病毒灭活是指采用物理或化学手段使病毒失去感染能力的处理过程，常用于制备病毒抗原，以及对被病毒感染的细胞或组织进行去毒处理。常见方法包括：

• 多聚甲醛灭活：通过交联蛋白质使病毒结构失活；
• β-丙内酯灭活：烷化并破坏核酸，抑制复制能力；
• 紫外（UV）灭活：引发核酸损伤，阻断病毒增殖。

这些方法可单独或联合使用，以在保证安全性的同时尽可能保持抗原性。本篇阐明使用β-丙内酯（BPL）进行病毒灭活的原则与管理要求。

2.适用范围

• 适用于多种DNA/RNA、包膜/非包膜病毒的化学灭活。
• 适用于细胞培养上清、组织匀浆、血清/蛋白溶液、疫苗原液等含病毒基质。
• 适用于制备灭活抗原（如疫苗抗原、诊断用抗原）及被病毒污染材料的去活化处理。
• 适用于对蛋白表位保留要求较高的场景（以项目验证为准）。
• 适用于可与BPL水解/去残留步骤顺利衔接的工艺流程。

3.生物安全与职责

• 生物安全等级：H5、H7高致病性禽流感病毒及H2N2亚型：BSL-3实验室内进行。其余流感病毒：BSL-2实验室内进行。
• 个人防护：合规防护服、一次性帽/鞋套、双层乳胶/丁腈手套、N95/同等级呼吸防护与防护眼罩/面屏。
• 化学安全（BPL）：BPL为强致突变/致癌可疑物，具挥发性与强反应性。必须在通风橱内、冰浴条件下配制与操作，严禁皮肤/黏膜接触与吸入。准备溢洒应急包（吸附材料、碱性中和液、封存容器）。

4.材料与设备

4.1试剂与耗材

• 9–10日龄SPF鸡胚
• β-丙内酯（BPL）：现配2%（w/v）溶液（取2 g BPL于100 mL预先冰浴的双蒸水中），全程冰浴、通风橱内操作
• 0.5 M磷酸氢二钠缓冲液（Na₂HPO₄）
• 7% NaHCO₃溶液（pH调整用）
• 无菌PBS（pH 7.2–7.4）
• 75%乙醇
• T75细胞培养瓶（用于后续安检/培养）
• 红细胞与红细胞凝集板（HA实验）
• 无菌离心管、移液枪与灭菌吸头、标识标签等

4.2仪器

照卵灯、开孔器、天平、超速离心机/台式离心机、水浴箱（37 °C，可定时混匀提示）、4 °C冰箱与冰浴装置、生物安全柜、通风橱、pH计。

5.操作流程（BPL灭活）

通用要求：所有开放步骤在生物安全柜内完成；BPL的配制与加入在通风橱内并置冰浴条件。

（1）病毒制备：取出澄清的病毒液；记录批号、滴度、体积、来源鸡胚信息。

（2）灭活前准备：预冷双蒸水与冰浴装置；在通风橱中配制2% BPL（2 g/100 mL冰浴双蒸水），混匀后全程置冰浴备用；准备0.5 M Na₂HPO₄与7% NaHCO₃；设定37°C水浴并设15 min混匀提醒。

（3）配比与加入：取38份病毒液于已标识无菌容器；加入1份0.5 M Na₂HPO₄轻混；在冰浴、通风橱内加入1份2%BPL（终浓度0.05%），立即充分混匀以保证与病毒颗粒充分接触；同步记录各试剂体积与加入时间。

（4）灭活反应（择一）：

• 方案A：37°C水浴2 h，期间每15 min轻柔颠倒混匀数次；
• 方案B：4°C过夜（≥12 h）静置反应；

注意：全程保持容器密闭，防止挥发暴露，不可两方案并用。

（5）pH调整：反应结束后在生物安全柜内以7% NaHCO₃缓慢滴加，将体系调至pH 7.3–7.4（经校准pH计测定），轻柔混匀。

（6）灭活有效性验证：鸡胚盲传三代；各代红细胞凝集（HA）检测均为阴性时判定“灭活完全”，方可进入后续工序/放行。

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