BioReagent 级 ，适用于对基线干扰要求严格的色谱和分析工作流程。
2-8°C储存,避光,-20°C储存,禁止冷冻。低温运输,超低温运输 。请查阅批次 COA 获取详细规格。
SDS、COA、产品数据表及规格说明书均可下载。可通过批号查询获取批次 COA。
在色谱分析、有机合成和交叉偶联反应领域已被 0 篇同行评审文献引用。
产品介绍
Glysite 是一种针对IgG抗体的位点特异性偶联技术，基于Fc聚糖重塑和点击化学。该技术能够从多个物种及亚型的IgG中制备出稳定且均一的抗体偶联物。通过对抗体进行Fc N-糖链去糖基化重塑，可借助稳健的点击化学实现位点特异性偶联，所得标记程度（DOL）或药物抗体比（DAR）为2。
本试剂盒的标记流程和原理如图1所示。1.使用超滤管对待标记抗体进行溶液置换和浓缩；2.去糖基化和叠氮基团引入：Fc特异性内切糖苷酶EndoS2可将多种IgG亚型及物种的Fc糖链水解至最内侧的GlcNAc部分，利用β-1,4-半乳糖基转移酶Y289L(GalT)，将含叠氮基团的UDP-GalNAz酶促连接到暴露的GlcNAc上，生成叠氮活化的抗体；3. 使用超滤管对Azide标记抗体进行纯化和浓缩；4. 加入炔基(Alkyne)、DBCO (Dibenzocyclooctyne) 或DIBO (Dibenzylcyclooctyne)修饰的荧光蛋白（PE、 PE-Cy5、PE-Cy7、 APC等）、荧光基团(Cy3、Cy5、AF488、AF647等)、生物素(Biotin)、胺基(Amine) 等标记物，通过应变促进的无铜点击化学（SPAAC）进行生物正交反应，形成稳定的三唑环连接，完成抗体标记。
每套Glysite 2位点抗体叠氮基快速标记试剂盒均包含足量试剂，可以标记约100-250μg (G1524532)、1mg (G1524533)和5mg (G1524534)的IgG抗体。试剂盒中提供的抗体浓缩管用于在抗体标记流程（见图1）的每一步对抗体进行纯化和浓缩。所有操作均在生理条件下进行，从而保持抗体的原有质量。由于偶联发生在Fc结构域，因此抗原结合位点的亲和力得以完好保留。
图1 Glysite 2位点抗体叠氮基快速标记试剂盒原理图
产品特点
产品组分
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所需自备材料
1. 离心机。
2. 用于标记的IgG抗体（不含载体蛋白和叠氮化物）。
3. Nanodrop或分光光度计。
4. 2mL、5mL、15mL和50mL离心管。
5. 恒温水浴锅或金属浴。
重要须知
1. 试剂盒使用之前，需将所有组分恢复至室温。
2. 在开始实验前，请将试剂管进行短暂离心，以确保所有物质均聚集于管底。
3. 在整个实验方案中必须避免使用叠氮化钠。
4. 请勿重复使用Endo S2大量离心柱。由于存在前次样品残留物污染的风险，我们不建议将其用于不同抗体的处理。
5. 本试剂盒不提供Alkyne、DBCO或DIBO修饰的荧光基团等标记物。
6. 如果使用螯合剂作为标记物，则在整个操作流程中使用无金属水（痕量分析级）至关重要。抗体不得接触玻璃或金属。
7. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
8. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用说明
1 抗体缓冲液置换和浓缩
1.1 如果抗体已在50mM Tris (pH7.5) 溶液中，且抗体浓度达5mg/mL，且缓冲液中不含叠氮化钠，可直接进行步骤2的去糖基化反应，无须进行本步骤即抗体的缓冲液置换和浓缩。
1.2 抗体浓缩管润洗。取一支抗体浓缩管，加入12mL 50mM Tris (pH 7.5) ，3500 × g离心10-15分钟，弃掉超滤内管和滤出液回收管中的液体。
注：确保浓缩管的膜面朝外，远离转子中心。
1.3 将5mg 待标记抗体溶液转移至浓缩管内管，用50mM Tris (pH 7.5) 将所加入的抗体稀释至12 mL刻度线处，轻轻吹打混匀。
1.4 3500 × g离心10-15分钟，内管滞留液体积应不超过1 mL。若滞留液体积大于1 mL，则重复离心，每次5分钟，直至体积减少至该范围。转移滤出液至新的离心管中，暂时保留。
注：超滤内管都有一定的漏液几率，建议超滤后，先保留滤出液回收管中溶液，确认超滤效果后再丢弃滤液，避免可能的样品损失。
1.5 向浓缩管内管加入50mM Tris (pH 7.5) 至12 mL刻度线处，轻轻吹打混匀。
1.6 重复步骤1.4和1.5两次。直至抗体体积浓缩至1 mL。
1.7 将超滤内管中的溶液转移至2mL离心管中。通过A280测定待标记抗体浓度，例如：A280为1.4时，蛋白浓度约为1mg/mL。
注：理论上抗体浓缩管的蛋白回收率>90%，但是部分蛋白样品回收率为60%也属于正常现象。
2 去糖基化：抗体Fc结构域上N-糖链的修饰
2.1 使用前将Endo S2 大量离心柱平衡至室温。掰断层析柱底部的封口帽，将离心柱置于15mL离心管中，并拧松上盖。于 200 × g 离心 1 分钟，以去除保存液。弃去流出液。
2.2 将离心柱放回15mL离心管中。向树脂上层加入1.5 mL 50mM Tris (pH7.5)。于 200 × g 离心 1 分钟，弃去流出液。
2.3 重复步骤 2.2 两次（共洗涤三次）。
2.4 插回底部红色封口帽。立即向离心柱中加入抗体溶液（1 mL）。盖上上盖密封离心柱。可用Parafilm™实验室封口膜或类似材料封住管盖和底部红色封口帽。
2.5 充分悬浮树脂介质，通过颠倒混匀，并确保柱内液体可流动。在37℃下，将离心柱置于旋转混匀仪上，颠倒旋转孵育 1小时。
2.6 取下底部封口帽，将离心柱置于新的15mL离心管中，并拧松上盖。于 1000 × g 离心 1 分钟，收集处理后的样品。
2.7 插回底部红色封口帽，加入 1 mL 50mM Tris (pH7.5)，盖上上盖密封。将离心柱颠倒混匀数次。
2.8 取下底部封口帽，将离心柱置于新的15mL离心管中，并拧松上盖。于 1000 × g 离心 1 分钟，收集处理后的样品（即再洗脱一次）。
2.9 合并所有收集的样品（包括步骤 2.6 中的样品）。
3 抗体叠氮基团连接
3.1 按下表在5mL离心管中依次加入各试剂配制反应溶液，涡旋混匀，然后短暂离心管体。用Parafilm™实验室封口膜或类似材料封住管盖，然后在37°C下过夜孵育。
| Reagent | 100-250μg IgG Antibody | 1mg IgG Antibody | 5mg IgG Antibody |
| Deglycosylated antibody | 200μL | 400μL | 2000μL |
| 50mM Tris, PH7.5 (Component C) | 5μL | 10μL | 50μL |
| UDP-GalNAz (Component D) | 10μL | 20μL | 100μL |
| Buffer additive (Component E) | 25μL | 50μL | 250μL |
| GalT(Y289L) (Component F) | 10μL | 20μL | 100μL |
| Total Volume | 250μL | 500μL | 2500μL |
4 叠氮基标记抗体的纯化和浓缩
此步骤用于去除过量的底物UDP-GalNAz。您也可以使用TBS或其他不含磷酸盐的缓冲液进行修饰抗体的纯化和收集。本试剂盒提供50mM Tris, PH7.5以供使用。
4.1 将酶促反应后的反应液转移至超滤管内管，加入50mM Tris (pH 7.5)至12 mL刻度线处，轻轻吹打混匀。
4.2 3500 × g离心10-15分钟，内管滞留液体积应不超过1 mL。若滞留液体积大于1 mL，则重复离心，每次5分钟，直至体积减少至该范围。弃去流出液。
4.3 向浓缩管内管加入50mM Tris (pH 7.5) 至12 mL刻度线处，轻轻吹打混匀。
4.4 重复步骤4.2和4.3四次。
4.5 用移液器从浓缩管中收集叠氮修饰抗体。
4.6 通过测定A280（以A280 = 1.4对应1 mg/mL）来确定抗体浓度(可选)。
注：理论上抗体浓缩管的蛋白回收率>90%，但是部分蛋白样品回收率为60%也属于正常现象。
5 Alkyne、DBCO或DIBO修饰物标记抗体
可使用炔烃修饰试剂盒，将多种探针和标记物连接至叠氮修饰抗体上。具体产品信息见下表。请遵照炔烃标记试剂盒附带的操作规程，完成标记物的连接，并对最终标记抗体进行纯化。
| Catalog No. | Product |
| G1528096 | GIySite 生物素抗体标记试剂盒(5mg) |
| G1528097 | GIySite AF488 抗体标记试剂盒(5mg) |
| G1528098 | GIySite AF594 抗体标记试剂盒(5mg) |
| G1528099 | GIySite AF647 抗体标记试剂盒(5mg) |
| G1528100 | GIySite R-PE 抗体标记试剂盒(5mg) |
| G1528101 | GIySite APC 抗体标记试剂盒(5mg) |
| G1528102 | GIySite PE-Cy5 抗体标记试剂盒(5mg) |
| G1528103 | GIySite PE-Cy7 抗体标记试剂盒(5mg) |
| G1528104 | GIySite APC-AF750 抗体标记试剂盒(5mg) |
| G1528105 | GIySite PerCP 抗体标记试剂盒(5mg) |
| G1528106 | GIySite PerCP-Cy5.5 抗体标记试剂盒(5mg) |
Product Introduction
Glysite is a site‑specific conjugation technology for IgG antibodies, based on Fc glycan remodeling and click chemistry. This technology enables the preparation of stable and homogeneous antibody conjugates from IgG of multiple species and subclasses. Through deglycosylation of the Fc N‑glycans on the antibody, site‑specific conjugation can be achieved via robust click chemistry, resulting in a degree of labeling (DOL) or drug‑to‑antibody ratio (DAR) of 2.
The labeling workflow and principle of this kit are shown in Figure 1. The steps are as follows:
1. Use Antibody concentrator to perform buffer exchange and concentration of the antibody to be labeled.
2. Deglycosylation and introduction of azide groups: The Fc‑specific endoglycosidase EndoS2 hydrolyzes the Fc glycans of various IgG subclasses and species to the innermost GlcNAc moiety. Using β‑1,4‑galactosyltransferase Y289L (GalT), the azide‑containing UDP‑GalNAz is enzymatically attached to the exposed GlcNAc, generating an azide‑activated antibody.
3. Use Antibody concentrator to purify and concentrate the azide‑labeled antibody.
4. Add alkyne‑, DBCO (dibenzocyclooctyne)‑, or DIBO (dibenzylcyclooctyne)‑modified labels such as fluorescent proteins (PE, PE‑Cy5, PE‑Cy7, APC, etc.), fluorophores (Cy3, Cy5, AF488, AF647, etc.), biotin, or amine, and perform a bioorthogonal reaction via strain‑promoted copper‑free click chemistry (SPAAC) to form a stable triazole linkage, completing the antibody labeling.
Each Glysite Duet Antibody Azido Modification Kit contains sufficient reagents for labeling approximately 100–250 μg (G1524532), 1 mg (G1524533), or 5 mg (G1524534) of IgG antibody. The antibody concentrator provided in the kit are used for purification and concentration of the antibody at each step of the labeling workflow (see Figure 1). All operations are carried out under physiological conditions, thus preserving the original quality of the antibody. Since conjugation occurs on the Fc domain, the affinity of the antigen‑binding sites is fully retained.
| 储运单元货号 | 储运单元名称 | 组分货号 | 组分名称 | 物理外观 | 1 reaction | 储存 | 单次测试使用量 |
| G1524534WT | Glysite 2位点抗体叠氮基快速标记试剂盒(5mg) (2-8℃组分) | G1524534A | Endo S2 大量离心柱 | 柱体 | 1 EA | 2-8℃， 禁止冷冻 | 每次反应需使用1套 |
| | | G1524534B | 抗体浓缩管(15mL) | 套管 | 2 EA | 2-8℃. | 每次反应需使用2套 |
| G1524534DT | Glysite 2位点抗体叠氮基快速标记试剂盒(5mg) (-20℃组分) | G1524534C | 50 mM Tris缓冲液(pH 7.5) | 无色液体 | 100 mL | -20℃. | 请按说明配制 |
| | | G1524534D | UDP‑GalNAz | 无色液体 | 100 μL | -20℃，避光 | 每次反应需使用100 μL |
| | | G1524534E | 缓冲液添加剂 | 无色液体 | 250 μL | -20℃. | 每次反应需使用250 μL |
| | | G1524534F | GalT(Y289L) | 无色液体 | 100 μL | -20℃. | 每次反应需使用100 μL |
危险品化学品经营许可证（带存储）