本公司生产的 Klenow Fragment, Exo-，即没有外切酶活性的 Klenow 片段，是大肠杆菌聚合酶 I (E.coli. DNA polymerase I)的大片段(Large Fragment)缺失了外切酶活性的突变体。Klenow Fragment, Exo-保留了 DNA 聚合酶 I 的 5'→3'聚合酶活性，但缺少完整的 Klenow 酶的 5'→3' 和 3'→5'外切酶活性。

组分和说明

K747451	Component	200U	1KU	5*1KU	Storage
K747451A	Klenow Fragment, Exo- (5 U/µl)	40μl	200μl	5*200μl	-20℃. Avoid freeze/thaw cycle.
K747451B	Reaction Buffer(10X)	200μl	1ml	5*1ml	-20℃. Avoid freeze/thaw cycle.

产品应用

5'突出末端的标记；随机引物法进行 DNA 标记；Sanger 双脱氧法进行 DNA 测序等。

产品优势

由于 Klenow Fragment, Exo-没有外切酶活性，其在末端补平时经常会在 3'末端额外加上 1 个或多个核苷酸，因此不能用于产生平末端而用于后续的连接。

使用说明

1.随机引物法进行 DNA 标记：

a.参考如下表格设置反应体系：

Reagent	Volume
DNA 10µl	(100ng)
Reaction Buffer (10X)	5µl
125µM random decamer or hexamer primer	10µl
补充无核酸酶的去离子水	至 40µl
混匀后沸水浴孵育 5-10 分钟，立即置于冰浴冷却。进行后续步骤前离心沉淀液
3 dNTP Mixture (0.25mM each , without the labeled dNTP)	4µl
[α-32P]-dNTP, ~110 TBq/mmol (3000Ci/mmol)	1.85MBq (50µCi)
Klenow Fragment, Exo-	1µl (5U)
补充无核酸酶的去离子水	至 50µl

b.按上表设置好反应体系后，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用 Vortex 在最低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体。

c.对于 random decamer primer，37℃孵育 5 分钟；对于 random hexamer primer，37℃孵育 10 分钟。

d.加入 4µl 0.25mM dNTP，混匀后 37℃孵育 5 分钟。

e.加入 1µl 0.5M EDTA，pH8.0 终止反应。

f.取 1µl 上述液体用于检测标记的效率。

g.用 Sephadex G-50 或 Bio-Gel P-60 或其它适当试剂盒纯化标记好的探针。

2.双链 DNA 5'突出(5' overhang)末端的标记：

a.参考如下表格设置反应体系：

Reagent	Volume
Digested DNA	10~15µl (0.1~4µg)
Reaction Buffer (10X)	2µl
[α-32P]-dNTP, ~15-30 TBq/mmol(400-800Ci/mmol)	0.74 MBq (20µCi)
或 [α-32P]-dNTP, ~110 TBq/mmol(3000Ci/mmol)	2.96 MBq (80µCi)
3 dNTP Mixture (2.5mM each , without the labeled dNTP)	2µl
Klenow Fragment, Exo-	0.2µl (1U)
补充无核酸酶的去离子水	至 20µl

b.按上述体系配好之后，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用 Vortex 在最低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体。

c.30℃孵育 15 分钟。

d.75℃孵育 10 分钟终止反应。

3.双链 DNA 5'突出末端的补平：

a.对于双链 DNA 5'突出(5' overhang)末端的补平，参考下表在冰浴中配制如下反应体系。

Reagent	Volume	Final Concentration
Nuclease-Free Water	(16.6-x)µl	-
dsDNA with 5’ Overhang	xµl	~0.5µM or 5-200ng/µl
Reaction Buffer (10X)	2µl	1X
dNTP Mix (2.5mM each)	0.4µl	50µM
Klenow Fragment, Exo- (5U/µl)	1µl	0.25U/µl
Total Volume	20µl	-

注 1：按上表设置好反应体系后，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用 Vortex 在最低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体；如果同时进行多个反应，可以把上表中除 dsDNA with 5’ overhang 之外的所有溶液和酶提前混合，分装到各反应管，最后再加入 dsDNA with 5’ overhang。

注2：dsDNA with 5’ Overhang如果是寡核苷酸，最终浓度可以约为0.5µM，如果是消化后的DNA质粒等最终浓度可以约为 5-200ng/µl。

b.37℃孵育 10 分钟。

c.75℃孵育 10 分钟以终止反应。

保存条件： -20℃保存，≤0℃运输

注意事项：

（1）酶使用时宜存放在冰盒内或冰浴上，使用完毕后宜立即放置于-20℃保存。

（2）本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

（3）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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