引言

        底物适用范围（substrate scope）是合成方法学研究中评价反应适用性的主要证据之一。研究者通常选择具有不同电子性质、位阻、取代形式和官能团的底物，在既定反应条件下测试其转化结果，由此判断一种方法能够处理哪些分子结构。

        底物数量可以反映实验规模，却不能单独表征反应普适性（reaction generality）。一组底物能够提供多少普适性信息，还与其来源、结构分布、选择规则以及低产率和失败结果的记录情况有关。

        2024年，Rana等人在 ACS Central Science 提出标准化底物选择策略，通过分子结构表示、无监督学习和聚类，从较大的候选底物集合中选择结构多样化的实验对象。该研究将底物范围中的“选哪些分子进行实验”转化为可以明确描述和重复执行的选样过程，并利用同一组底物比较不同反应的适用特征。[1]

1. 底物数量为什么不能单独评价反应普适性

1.1 底物范围属于有限取样结果

一种反应潜在面对的底物数量远高于实验能够实际测试的数量。任何底物范围表都可以抽象为以下过程：

候选底物集合 → 选择部分底物 → 实验测试 → 记录结果 → 推断反应适用性

因此，20个、50个或100个底物都属于更大候选集合中的有限样本。样本数量增加能够提高数据量，但信息增量还取决于新增底物与已有底物之间的结构差异。[1]

        例如，连续测试一系列苯乙烯衍生物，可以系统考察芳环电子效应、取代位置和位阻变化，对建立局部结构—反应性关系具有直接意义。如果大量新增实例仍围绕相近骨架展开，它们主要增加同一结构类型内部的信息，对杂环、多官能团或高复杂度结构的适用情况提供的信息相对有限。

底物范围的评价因此至少包含三个维度：

        Rana等人对现有方法学研究的分析显示，近年来论文中的底物实例数量明显增加，但扩大后的底物范围可能包含较多结构冗余。增加相似的成功实例能够进一步验证已有反应趋势，却不能自动增加对其他结构类型的认识。[1]

1.2 底物选择和结果呈现会影响普适性判断

        传统底物范围通常依赖研究者的化学经验进行设计。实验人员容易优先选择预计产率较高、容易获得或与模型底物结构接近的化合物，形成选择偏差（selection bias）。实验完成后，成功和较高产率结果进入正式底物范围的概率也高于低产率或失败实验，形成报告偏差（reporting bias）。[1]

        这两类数据提供不同信息。成功结果确认某类结构能够完成目标转化；低产率结果反映该结构与现有反应条件的适配程度较低；经过规范实验得到的失败结果则直接记录不适用的结构类型。缺少后两类数据时，底物范围更容易集中展示反应能够实现的转化，而对其适用限制描述不足。作者因此强调，低产率和失败数据对于确定新反应的适用范围及后续方法改进具有独立价值。[1]

2. 反应普适性评价的基本条件

        标准化底物选择首先需要回答的不是“测试多少个分子”，而是明确评价对象和选样规则。Rana等人的方法将这一过程拆分为参照分子集合、候选底物集合、结构选择规则和实验结果判据几个连续环节。[1]

2.1 明确参照分子集合

        “反应具有较广普适性”需要对应一个具体的分子集合。针对药物相关合成，作者选择DrugBank中的药物分子建立参照结构空间，使最终实验底物尽量涉及药物分子中存在的不同结构特征。[1]

        参照集合的选择决定评价对象。以DrugBank为参照，所得结果主要反映对药物相关结构的覆盖情况；农用化学品、材料单体或其他分子类别需要采用与研究目标相对应的数据集合。作者也明确讨论了DrugBank选择所带来的数据集偏差。[1]

2.2 建立可实验的候选底物集合

        实际用于反应测试的分子还受到化合物类别、商业可获得性、价格以及已经确定的反应限制影响。

        作者提出先根据经典底物范围和已有反应知识建立过滤条件，再从符合条件的候选分子中进行结构多样性选择。这样可以把已经确认的官能团不兼容性或位阻限制明确写入筛选过程，避免这些限制隐含在人工选样之中。[1]

2.3 固定选样规则和评价标准

        候选集合确定后，实验对象按照统一的分子结构表示、降维和聚类规则选取。标准化选样在此指按照预设结构规则从候选集合中选择实验对象，不属于按照总体组成比例进行的概率抽样，因此也不用于计算整个候选集合的总体反应成功率。[1]

        实验评价同样需要明确判据。同一种反应中的选定底物按照相应反应条件测试；比较不同反应时，各反应仍采用各自的反应体系，但使用相同的底物集合和相同的结果判定标准。这样获得的数据才具有直接比较的基础。[1]

3. 基于结构多样性的标准化底物选择

3.1 ECFP建立统一的分子结构表示

Rana等人首先将DrugBank中的分子转换为扩展连接指纹（extended-connectivity fingerprint，ECFP）。

ECFP属于圆形拓扑分子指纹，以原子为中心逐层编码周围的局部结构环境，可以将分子中的子结构特征转换为可计算的结构表示。不同分子由此能够按照统一方式进行结构相似性比较。[3]

ECFP提供的是分子结构信息。在这项研究中，它承担的作用是区分不同结构特征，并不直接描述反应产率或反应速率。

3.2 UMAP和层次聚类组织分子结构分布

        高维分子指纹随后通过统一流形逼近与投影（Uniform Manifold Approximation and Projection，UMAP）进行非线性降维。UMAP是一种流形学习降维算法，可将高维数据中的结构关系映射到较低维表示中。[4]

        作者进一步比较不同聚类方法，最终采用凝聚型层次聚类划分降维后的药物结构分布。研究考察了10～25个聚类数量对应的轮廓系数，没有发现明确的变化趋势，最终从实验可操作性出发选取15个聚类。论文同时指出，更大的聚类数量同样可以采用，因此15属于本研究的实验设计参数，并非反应普适性评价的固定样本数。[1]

        作者将分子结构映射与已有反应知识结合形成完整的底物选择流程（论文图2）。该流程包含两条相互衔接的信息路径：一方面，将DrugBank中的分子进行ECFP指纹化、UMAP降维和层次聚类，建立药物相关结构空间（图2B）；另一方面，根据经典底物范围和已有反应知识明确反应位点及已知不兼容结构，并将这些限制转化为结构过滤规则，对候选底物进行预筛选（图2A）。筛选后的候选底物再投影到DrugBank结构空间中，并优先从各聚类中心附近选择实际可获得的化合物作为标准化测试底物。[1]

        标准化底物选择工作流程。 图A表示根据经典底物范围和已有反应知识定义反应兼容性及结构过滤条件；图B表示经UMAP降维和层次聚类建立的DrugBank药物化学空间。经筛选的候选底物被投影到该结构空间中，并从各聚类中心附近选择代表性实验底物。转载自文献[1]，CC BY 4.0。

3.3 从3811个烯烃中选择15个测试底物

        在烯烃案例中，作者首先从Reaxys检索商业可获得的烯烃，再采用价格低于100欧元/克、分子量低于700 Da等条件进行筛选。四取代烯烃和含游离胺的化合物也被排除，因为前期研究已经确认这两类结构与光化学亚氨基羧化条件不相容。筛选后得到3811个候选烯烃。[1]

        这些候选烯烃被投影到已经建立的DrugBank结构分布中，再从各聚类中心附近寻找可获得的候选物。距离聚类中心最近的化合物难以获得时，可考察距离中心较近的其他候选结构。[1]

        最终得到的15个烯烃覆盖末端烯烃、1,1-二取代烯烃、1,2-二取代烯烃和三取代烯烃，并包括缺电子烯烃、未活化烯烃和富电子烯烃，以及醇、酯、酰胺、醚、硅醚、卤素、硫醇和叔胺等官能团。较大比例的入选结构具有多官能团特征。[1]

标准化底物选择流程可概括为：

参照分子集合 → ECFP结构表示 → UMAP降维 → 层次聚类 → 建立并过滤候选底物集合 → 候选底物投影 → 从不同聚类附近选择代表底物 → 实验评价

这一流程中的计算方法负责决定实验对象，具体底物能否发生反应仍由实验结果确定。[1]

4. 标准化底物集对两种烯烃反应的评价结果

4.1 同一组底物用于两个不同反应

作者选择两种烯烃转化测试这一选样方法。

        第一种是Glorius团队2022年发表于 Nature Chemistry 的光化学烯烃亚氨基羧化反应。原始研究利用能量转移光化学过程实现烯烃或（杂）芳烃的双官能团化，可一步构建β-氨基酸衍生物，共报道多达约140个实例。2024年的研究指出，其中已经包括100种不同烯烃。[1,2]

        第二种是锇催化烯烃双羟基化。相同的15个标准化烯烃分别接受两种反应各自的实验条件。所有实验均在0.2 mmol规模进行，论文将获得可分离的预期产物且产率高于10%设定为成功判据。[1]

实验结果如下[1]：

        53%和47%仅描述这15个标准化测试底物中的实验结果。由于这些底物按结构多样性选择，并非按3811个候选烯烃的实际组成比例随机抽取，上述比例不对应全部烯烃的总体反应成功率。[1]

        相同的15个烯烃分别接受两种反应条件后，两种方法达到成功判据的底物数量接近，但具体成功和失败的结构并不相同（论文图4）。这种差异使反应适用性的比较从成功实例数量进一步落实到具体分子结构。[1]

标准化烯烃底物集对两种反应的实验评价。 同一组15种烯烃分别用于锇催化双羟基化和光化学亚氨基羧化；图中给出了各底物的实验结果、分离产率及两种反应的总体表现。实验规模为0.2 mmol，作者以获得超过10%分离产率的预期产物作为成功判据。转载自文献[1]，CC BY 4.0。

图片来源： Rana D, Pflüger P M, Hölter N P, et al. ACS Central Science, 2024, 10, 899–906, Figure 2&4. DOI: 10.1021/acscentsci.3c01638. © 2024 The Authors，CC BY 4.0。

4.2 相近的成功数量对应不同的适用结构

        两种反应分别有8个和7个底物达到成功标准，数量接近；逐一比较相同底物的反应结果后，两种方法表现出明显不同的结构适用特征。[1]

        未活化烯烃L1和N1在两种反应中均能发生目标转化，去甲替林衍生物E1也能够参与两种反应，但产率相对较低。[1]

        1-乙烯基三唑A1、乙烯基环丙烷衍生物B1、电子缺陷烯烃M1和三氟乙基丙烯酸酯K1在双羟基化条件下未发生预期转化，却能够进入光化学亚氨基羧化反应体系。其中B1出现环丙烷开环，M1发生脱氯及后续β-氢消除，说明“发生目标类型转化”之外，副反应和产物变化同样属于评价反应适用性的重要实验信息。[1]

        另一组底物表现出相反的反应选择。四氢吡啶衍生物F1、带有β-内酰胺结构的D1、H1、三乙酰基-D-葡萄糖烯O1以及C1等复杂烯烃能够形成相应二醇，而在光化学亚氨基羧化条件下没有检测到预期产物。G1、I1和J1则在两种反应中均未达到成功标准。[1]

这些结果可以按反应表现分为三种类型：

        同一组底物因此提供了比“成功实例总数”更细致的信息。8个和7个成功实例在数量上接近，但成功底物并不完全重合；单独比较成功数量会掩盖两种反应处理具体结构类型时的差异。[1]

4.3 多官能团复杂结构暴露出不同反应的适用限制

        标准化测试中，光化学亚氨基羧化对苯乙烯、未活化烯烃和部分缺电子烯烃表现出的反应趋势与原始研究一致，同时在携带多个潜在反应官能团的复杂底物中出现更多未得到预期产物的情况。[1]

        作者进一步指出，2022年原始底物范围也包含复杂分子，但其中部分实例的烯烃反应位点与其他反应性官能团距离较远。结构多样性导向的选样增加了其他多官能团组合的测试，因此补充显示了该光化学反应在复杂底物中的适用限制。[1,2]

        锇催化双羟基化在这组测试中能够处理多种复杂烯烃，同时在缺电子烯烃和杂原子连接烯烃等结构上表现出已知限制。两类反应由此形成不同的适用结构分布。[1]

        这一比较说明，反应普适性的有效信息不仅包括“成功了多少个底物”，还包括“哪些结构成功、哪些结构失败，以及不同方法的成功和失败结构是否相同”。

5. 标准化选样提供的实质性信息

5.1 降低相似结构重复带来的信息冗余

        经典底物范围常采用围绕模型底物逐步改变取代基的方法。这种设计非常适合研究电子效应、位阻和取代模式，但连续增加相近结构时，对更广结构类型的新增信息会逐渐减少。

        结构多样性导向的选样将有限实验分配到不同结构区域，使测试集合同时包含电子性质、官能团组合和分子复杂程度差异较大的底物。在实验数量受限时，这种设计可以增加所考察的结构类型。[1]

5.2 相同底物集合提高不同反应之间的可比较性

        不同论文通常采用各自设计的底物范围。一种反应可能大量测试芳基烯烃，另一种则重点展示复杂天然产物衍生物，即使两篇论文都报道50个底物，数据也难以直接横向比较。

        Rana等人的实验把同一组15个烯烃分别用于两种反应，在相同底物身份和相同成功判据下比较实验结果。这样得到的不只是两个成功比例，还包括每一种具体结构对不同反应体系的响应。[1]

5.3 低产率和失败结果进入反应适用性评价

        按照预设规则选出的底物可能产生低产率、异常产物或完全失败。保留这些结果后，反应范围同时记录可行结构和不适用结构。

        Rana等人提出，标准化测试会包含相当比例的低产率或失败实例，这些负结果有助于描述新反应的适用限制，也能够提示后续方法开发需要解决的结构问题。[1]

5.4 经典底物范围与标准化测试承担不同任务

        作者最终提出两阶段评价方案：先进行较精简的经典底物范围，用于识别电子效应、位阻和基本反应趋势；随后加入按照标准化规则选择的底物，测试更广泛的结构类型。[1]

        标准化底物选择因此没有削弱经典底物范围的作用，而是增加了一类不同性质的实验信息：经典范围侧重解释结构变化怎样影响反应，标准化集合侧重检验这些反应规律在结构差异较大的分子中能够延伸到什么程度。[1]

6. 方法适用范围与结论

6.1 结构代表性不能直接转换为反应性代表性

        ECFP、UMAP和聚类依据分子结构特征组织化合物，而有机反应结果还受到反应中心附近的电子性质、位阻、构象、配位能力及竞争反应等因素影响。

        因此，某个底物位于聚类中心附近，只能说明它在所采用结构表示下具有较强的结构代表性。作者明确指出，聚类中心附近的单个分子不能完整代表整个聚类中所有分子的反应性；UMAP参数和聚类参数变化后，也可能得到相似但不完全相同的一组15个底物。[1]

        这一限制决定了标准化底物选择是一种实验设计方法，不能替代具体反应实验，也不能根据结构映射直接预测未测试底物的产率。

6.2 少量标准化底物不能估计完整底物集合的总体成功率

        15个底物相对于整个烯烃候选集合仍然很少。作者也指出，微小结构变化可能显著影响反应结果，因此少量分子无法完整捕获一个底物类别中的全部反应趋势。[1]

        同时，标准化底物按照结构区域主动选取，并不满足按总体组成比例随机抽样的条件。8/15或7/15适合描述这套测试集合中的表现，不能解释为整个烯烃类别分别具有53%或47%的反应成功概率。[1]

6.3 反应普适性的证据由数量、结构覆盖和结果完整性共同构成

        底物实例数量仍然是反应评价的重要信息。它说明完成了多少实验，却不能单独回答这些实验覆盖了哪些结构类型，也不能说明未成功的结构是否得到记录。

Rana等人的研究将底物选择过程进一步规范为：

定义参照分子集合 → 建立候选底物集合 → 明确已知反应限制 → 按统一结构规则选择实验对象 → 按预设判据测试 → 同时记录成功与失败结果。[1]

        在实际验证中，两种烯烃反应分别有8个和7个标准化底物达到成功标准，表面上的成功数量十分接近；逐一比较15个相同结构后，却可以看到两种反应明显不同的适用结构和失效类型。[1]

        这也是标准化选样对反应普适性评价增加的关键信息：数量描述实验规模，结构分布描述实验考察了什么，成功与失败结果共同描述反应在这些结构中的实际表现。

        当这三类信息同时明确时，底物范围才能从成功实例的累积进一步形成具有明确评价对象、可重复选样规则和可比较实验结果的反应适用性证据。

7. 底物范围标准化评价相关代表化学品

表1 反应评价相关试剂与代表性测试底物

表2 光化学关键肟草酸酯试剂制备相关原料与试剂

注：以上为阿拉丁代表性科研相关产品，具体用途应结合产品规格、批次COA及目标反应或评价体系确定。更多产品规格、级别和COA信息可用“品名/CAS/货号”在阿拉丁官网检索。

参考文献

[1] Rana, D.; Pflüger, P. M.; Hölter, N. P.; Tan, G.; Glorius, F. Standardizing Substrate Selection: A Strategy toward Unbiased Evaluation of Reaction Generality. ACS Central Science 2024, 10(4), 899–906. DOI: 10.1021/acscentsci.3c01638.

[2] Tan, G.; Das, M.; Keum, H.; Bellotti, P.; Daniliuc, C.; Glorius, F. Photochemical Single-Step Synthesis of β-Amino Acid Derivatives from Alkenes and (Hetero)arenes. Nature Chemistry 2022, 14(10), 1174–1184. DOI: 10.1038/s41557-022-01008-w.

[3] Rogers, D.; Hahn, M. Extended-Connectivity Fingerprints. Journal of Chemical Information and Modeling 2010, 50(5), 742–754. DOI: 10.1021/ci100050t.

[4] McInnes, L.; Healy, J.; Melville, J. UMAP: Uniform Manifold Approximation and Projection for Dimension Reduction. arXiv 2018, arXiv:1802.03426; v3 revised September 18, 2020. DOI: 10.48550/arXiv.1802.03426.

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