Human Th17染色试剂盒（-20℃组分）：操作方案与使用指南
Human Th17染色试剂盒（-20℃组分）：操作方案与使用指南
Human Th17 Staining Kit (-20℃ Components) is 一款专为流式细胞术设计的试剂系统，能够对人外周血单个核细胞及其他人类免疫细胞样品中的Th17淋巴细胞进行可靠的胞内细胞因子染色与表型鉴定。
- 产品货号
- H1521238DT
- 储存温度
- -20℃（适用于指定组分）
- 应用
- 人类Th17细胞的流式细胞术鉴定
- 细胞类型
- 人类Th17辅助性T细胞（CD4+ IL-17A+淋巴细胞）
- 样本类型
- 人外周血、PBMC或培养的T细胞
- 主要细胞因子靶标
- IL-17A（胞内）
背景：Th17细胞在人类免疫中的作用
T辅助细胞17（Th17细胞）是CD4+ T淋巴细胞的一个独特亚群，以产生促炎细胞因子白细胞介素-17A（IL-17A）并表达主转录因子RORγt为特征。Th17细胞在宿主抵御胞外病原体（尤其是真菌和某些细菌）以及类风湿关节炎、银屑病、炎症性肠病和多发性硬化等多种自身免疫和炎症性疾病的发病机制中发挥关键作用。
准确鉴定和定量人类Th17细胞通常需要在细胞刺激及固定/通透处理后，联合进行表面标志物染色（如CD4）和IL-17A胞内细胞因子染色。Human Th17染色试剂盒（-20℃组分）经过优化，旨在简化这一多步骤流程，为研究人员提供经过验证的试剂系统，实现一致且可重复的Th17流式细胞检测。
试剂盒组成与储存要求
Human Th17染色试剂盒（-20℃组分）包含一套精心配制的试剂，用于完整的Th17染色工作流程。关键组分类别通常包括：
- 刺激试剂：细胞刺激剂（如PMA和离子霉素）及蛋白转运抑制剂（如布雷菲德菌素A或莫能菌素），用于在染色前促进胞内IL-17A的积累。
- 表面染色抗体：偶联适当荧光素的抗人CD4抗体，用于Th17细胞圈门。
- 固定和通透试剂：固定缓冲液和通透缓冲液，在保留细胞形态和表面抗原染色的同时，使抗体能够进入胞内IL-17A。
- 胞内染色抗体：偶联适当荧光素的抗人IL-17A抗体，用于Th17细胞鉴定。
储存：标注为-20℃的组分须在收到后立即储存于-20℃，并避光保存。请参阅各组分标签及试剂盒说明书了解具体储存条件，部分组分可能有所不同。避免反复冻融以保持试剂完整性。
审阅说明：具体组分名称、体积和浓度应在发布前对照H1521238DT官方说明书进行核实。
分步染色操作规程
以下通用规程概述了使用本试剂盒进行人类Th17细胞染色的推荐工作流程。具体批次说明和优化体积请始终参阅官方试剂盒说明书。
- 细胞制备：分离人PBMC或从相关组织制备单细胞悬液，将细胞密度调整至试剂盒说明书推荐浓度（通常为1–5 × 10⁶个细胞/mL）。
- 刺激：使用所提供的刺激试剂在37℃、5% CO₂培养箱中刺激细胞至推荐时长（通常4–6小时）。在刺激末期加入蛋白转运抑制剂，以阻止细胞因子分泌。
- 表面染色：刺激结束后洗涤细胞，在冰上或4℃条件下用抗CD4抗体染色推荐时间（通常20–30分钟）。如需排除死细胞，可在此步骤同时进行活力染料染色。
- 固定：洗涤细胞后重悬于所提供的固定缓冲液中，在推荐温度和时间条件下孵育（通常室温或4℃，20–30分钟）。如有需要，固定后的细胞可在4℃保存过夜后再继续操作。
- 通透与胞内染色：用通透缓冲液洗涤固定细胞，将细胞重悬于含推荐浓度抗IL-17A抗体的通透缓冲液中，在推荐时间条件下孵育（通常室温或4℃，20–30分钟）。
- 终洗与上机检测：用通透缓冲液或PBS洗涤细胞两次，重悬于适当缓冲液中，在流式细胞仪上进行检测。在活细胞CD4+ T细胞中圈门，将IL-17A+群体鉴定为Th17细胞。
对照设置：请务必设置未染色对照、同型对照和荧光减一（FMO）对照，以准确界定阳性和阴性群体。
常见问题故障排除
即使使用优化试剂盒，流式细胞术胞内染色仍可能遇到挑战。以下表格总结了常见问题及推荐解决方案：
| 问题 | 可能原因 | 推荐措施 |
|---|---|---|
| IL-17A信号弱或缺失 | 细胞刺激不足；细胞因子提前分泌；过度固定 | 确认刺激试剂活性；在正确时间点加入转运抑制剂；避免过度固定；检查抗体批次和稀释度 |
| 背景高/非特异性染色 | 洗涤不充分；通透缓冲液不兼容；抗体非特异性结合 | 增加洗涤步骤；确保使用正确的通透缓冲液；设置FMO对照评估背景 |
| 刺激后细胞活力低 | 刺激时间过长或试剂浓度过高；细胞密度不适 | 滴定刺激条件；使用活力染料圈定活细胞；优化细胞密度 |
| CD4表面染色信号丢失 | 过度通透；固定导致表位破坏 | 优化固定和通透时间；使用经验证的适合固定/通透细胞的抗CD4克隆 |
常见问题
Human Th17染色试剂盒（-20℃组分）适用于哪些细胞类型？
本试剂盒针对人外周血单个核细胞（PBMC）进行了优化，也可用于其他人类免疫细胞制品，包括全血（需进行适当的裂解步骤）和体外培养的T细胞。本试剂盒未针对非人类样本进行验证。
为何本试剂盒的某些组分必须储存于-20℃？
标注需-20℃储存的组分（如抗体偶联物和某些刺激试剂）在较高温度下易降解。在-20℃储存可确保长期稳定性，保持抗体结合活性，并维护荧光素偶联物的完整性。使用前请在室温或冰上轻柔解冻，避免反复冻融。
使用本Th17染色试剂盒时应设置哪些对照？
为准确解读数据，请设置未刺激阴性对照（不加刺激试剂的细胞）、同型对照抗体（与每种检测抗体匹配），以及每个荧光通道的荧光减一（FMO）对照。同时建议使用活力染料排除死细胞，因为死细胞可能发生非特异性抗体结合，产生假阳性信号。
本试剂盒除IL-17A外，是否还可用于RORγt转录因子染色？
Human Th17染色试剂盒（-20℃组分）专为IL-17A胞内细胞因子检测而配制。如需同时进行RORγt染色，研究人员应验证抗体和缓冲液的兼容性，因为转录因子染色可能需要不同的固定和通透条件。请参阅试剂盒说明书或联系Aladdin Scientific技术支持以获取联合检测的指导建议。
染色后如何在流式细胞仪上对Th17细胞进行圈门？
使用标准散射光圈门（FSC对SSC）鉴定淋巴细胞，然后应用活力圈门排除死细胞，在活淋巴细胞群体中圈定CD4+ T细胞。最后，在CD4+圈门内，使用FMO对照准确设定阳性阈值，将IL-17A+群体鉴定为Th17细胞。
参考文献
- Harrington LE, Mangan PR, Weaver CT. Expanding the effector CD4 T-cell repertoire: the Th17 lineage. Curr Opin Immunol. 2006;18(3):349-356.
- Kolls JK, Lindén A. Interleukin-17 family members and inflammation. Immunity. 2004;21(4):467-476.
- Maecker HT, Trotter J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry A. 2006;69(9):1037-1042.
- Aladdin Scientific. Human Th17 Staining Kit (-20℃ Components) Product Insert, SKU H1521238DT.
产品仅供科研与开发使用，不用于人体、动物、诊断或治疗。
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