Rt-qPCR（实时荧光定量PCR）是分子生物学的基础实验，主要包括三大步骤：RNA提取、逆转录成cDNA、实时荧光定量PCR。虽然看起来逆转录实验只是将几种试剂加在离心管中混匀，进行反应即可，但在实际操作过程中，还有许多细节需要注意。

        根据其化学原理不同，Rt-qPCR可以分为2种检测方法：一种为探针法，如TaqMan探针法；一种为染料法，如SYBR Green Ⅰ染料法。今天来给大家分享一下做Rt-qPCR实验（SYBR染料法）时的加样心得，助力大家在做Rt-qPCR实验时，加样高效又准确！

01 上样前的点样规划

        首先，根据实验需要进行96孔板孔位规划，实验需要满足3个技术重复及至少3个生物学重复。

        假设一次实验需要检测8个样品中3种目的基因表达，则需要的孔位数为：

        8（样品数）×4（目的基因数+内参基因）×3（三个技术重复）=96。

        如下图所示96孔板示意图（从上到下依次为A-H，从左到右依次为1-12），每个大方框（橙色/蓝色）内是同一种cDNA，A列及E列均加上内参基因的引物。3种目的基因（如基因A、B、C）分别按如下分布：

02 准备试剂和样品

        将Rt-qPCR所需要的试剂如：无酶水，SYBR，上下游引物等以及样品（cDNA）置于冰上备用。

03 混合无酶水、SYBR、上下游引物

        根据以上点样规划，计算每种引物所在位置孔位数，如内参基因为A列及E列上样，需要加24个孔，一般配Mix时需要多配2个孔，我们按26个孔的量，除cDNA（1μL）后需配置余下体系。

        准备一个EP管，按照试剂盒提示（此为takara试剂盒上样体系，共计20μL）分别计算：

        无酶水：7.4μL×26=192.4μL

        SYBR：10μL×26=260μL

        上下游引物各：0.8μL×26=20.8μL

        26个孔混合物的总量：19μL×26=494μL=260μL+20.8×2μL+192.4μL

        充分混合均匀，置冰上备用。按照同样的方法分别配置含有目的基因的混合物。

04 上样

        第一次上样：将上述混合物按照点样规划加入相应孔位，例如A列及E列均加含有内参基因的混合物，每孔19μL。

        Tips：每次加入小孔底部，不用更换枪头，加含有另一种引物的混合物时再更换。

        第二次上样：每孔加入1μL cDNA。

        Tips：为了避免污染，每次需更换枪头。

        为了提高上样准确性，教大家2个上样小妙招：

        ① 首先，根据实验需要进行96孔板孔位规划，实验需要满足3个技术重复及至少3个生物学重复。

        ② 准备好一个完整的无酶10μL枪头盒，对应好96孔板位置取用枪头，避免上样失误。

05 上机

        上样完成后，贴好封板膜，离心（一定要记得离心！！！否则上机后没有底物不反应或混合不均实验差异大），使体系全部混合后再上机。如果因不可抗力不能及时上机，需将96孔板置于4℃避光保存（亲测4℃放置4h左右再上机也不影响结果）。

        以上是跟大家分享的Rt-qPCR实验的加样技巧，希望帮助大家更顺利的完成实验~

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