改编自 Arur 和 Nayak（Schedl 实验室，华盛顿大学圣路易斯）提供的《细菌中IPTG诱导与蛋白提取》

引言

利用大肠杆菌（E. coli）的 lac 操作子系统（lac operon） 来表达重组蛋白，已成为生物科研中实现大规模蛋白生产的重要手段。在该系统中，若无诱导剂或乳糖存在，lacI 基因编码的抑制子蛋白会与操作子结合并阻断基因转录。
而当加入化学诱导剂如 IPTG（异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷） 后，它可变构性地结合 lac 抑制子，使其从操作子（lacO）上解离，从而激活操作子下游基因的表达（见图1）。

这些表达的重组蛋白随后可用于下游的纯化与分析。蛋白诱导方式主要有两种：

· 快速诱导（Fast induction）

· 慢速诱导（Slow induction）

快速诱导并不适用于所有蛋白，且可能导致产量低或蛋白不溶；而慢速诱导则有助于提高蛋白的可溶性。建议先试验两种方式后再进行规模化表达。

本文描述了一种通用的诱导与提取方法，具体可根据细菌菌株、重组蛋白和质粒类型优化调整。

实验材料

· LB 培养基 + 抗生素（氨苄青霉素、卡那霉素、羧苄青霉素等）

· IPTG（Aladdin 货号：I274316）

· 溶菌酶（Aladdin 货号：L274271）

· 冰

· DTT（Aladdin 货号：D104859）

· 蛋白酶抑制剂

· N-月桂酰肌氨酸钠（Sarkosyl）Aladdin各规格产品

· Triton X-100（Aladdin各规格产品）

· 镍琼脂糖磁珠

· 冰冷 PBS 缓冲液（Aladdin 货号：P397924）

· 咪唑（Aladdin各规格产品）

· Tris-HCl（Aladdin 各规格产品）

· SDS

· 甘油（Aladdin 货号：G116206）

· EDTA 二钠（Aladdin 各规格产品）

· 溴酚蓝（Aladdin 货号：B109643）

· 无菌去离子水（dH₂O）

· β-巯基乙醇（BME）（Aladdin 货号：M301574）

加样缓冲液的配制（4X）（总量40 ml）

1. 2.0 ml 1M Tris-HCl，pH 6.8（终浓度 50 mM）

2. 0.8 g SDS（终浓度 2%）

3. 4.0 ml 甘油（终浓度 10%）

4. 1.0 ml 0.5M EDTA（终浓度 12.5 mM）

5. 8 mg 溴酚蓝（终浓度 0.02%）

6. 补足至 40 ml，用无菌水

注意：使用前添加新鲜的 1% β-巯基乙醇（BME）

实验方法

快速诱导法（Fast Induction）

1. 从新鲜的菌落中挑取单克隆，接入含抗生素的 1–2 ml LB 液体培养基中。

2. 30°C 或 37°C 恒温振荡培养过夜。

3. 取前夜培养液按 1:50 稀释（如前夜为37°C，则稀释 1:100），继续培养 3–4 小时于 37°C。

注：此培养物 1 ml 将用作未诱导对照，其余用于后续诱导。

4. 预先在 15 ml 离心管中配制 1 ml LB + 抗生素 + 1mM IPTG 溶液，在 37°C 预热 10 分钟。

注：IPTG 终浓度可根据实验需求在 0.1–1mM 范围调整。

5. 取 1 ml 菌液（未诱导样品），离心 30 秒后弃上清，冷冻保存于 –20°C，作为 未诱导对照。

6. 将 1 ml IPTG 诱导液加入剩余菌液（共2 ml），继续 37°C 诱导 3–4 小时。

注：此时 IPTG 最终浓度为 0.5mM。

7. 取 1 ml 诱导样品，离心并弃上清，冻存于 –20°C，作为 诱导样品。

8. 准备上样用于 SDS-PAGE 分析：
a. 向诱导和未诱导样品中加入 100 µl 1X 加样缓冲液（含1% BME）
b. 涡旋混匀10秒至1分钟，直到无菌团
c. 沸水煮样 3–5 分钟
d. 室温下离心 30 秒，根据凝胶或蛋白量加载 5–25 µl（常用 10 µl）

提示：若样品煮沸时间过长，DNA 会释放使其粘稠，应缩短处理或重新提取。

慢速诱导法（Slow Induction）

· 与快速诱导方法基本一致，仅将第6步改为：

o 使用 预热至 20°C 的 IPTG 培养基诱导，在 20°C 下缓慢振荡培养 12–16 小时

可溶性蛋白提取

该方法适用于 FLAG、GST 和 His 标签蛋白，不适用于 MBP 标签（对表面活性剂敏感）：

1. 用 2 ml 冰冷 STE 缓冲液（10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA）洗涤菌体一次

2. 用含 100 µg/ml 溶菌酶的 STE 缓冲液重悬菌体（来源于 10 ml 培养）

3. 冰上孵育 15 分钟

4. 加入 DTT（终浓度 5 mM）

5. 添加蛋白酶抑制剂（如 PMSF，终浓度 100 µM）

6. 加入 N-月桂酰肌氨酸钠（10% 储备液）至终浓度 1.5%，裂解细胞

7. 超声细胞破碎，2 个循环，每次 6 分钟

8. 4°C，100 g 离心 5 分钟

9. 转移上清至新管中，加入 Triton X-100（10% 储备液）至终浓度 2%

10. 取 100 µl 镍琼脂糖珠（用于 His 标签纯化），用冰冷 PBS 洗两次

11. 加入含有 Triton X-100 的蛋白上清液中，室温摇动孵育 30–60 分钟

12. 用含 20 mM 咪唑的冰冷 PBS 洗涤磁珠 4 次（每次 1 分钟）

注：可加入 0.1–1% TWEEN 20 降低背景杂蛋白结合

13. 最后加入 1X 加样缓冲液（含 1% BME），煮沸 3 分钟，进行 SDS-PAGE 分析

实用建议

· 选择适合重组蛋白表达的细菌菌株

· 推荐使用标签蛋白（如 N 端 His 标签）以简化纯化流程

· 产生真核蛋白时，选择含有额外 tRNA 的表达菌株

· 羧苄青霉素（Carbenicillin）比青霉素更稳定，更适合蛋白表达

· 低温诱导有助于蛋白正确折叠和提高可溶性

参考文献

· Arur, S. and Nayak, S. IPTG Induction. Retrieved 2018 from: http://genetics.wustl.edu/tslab/protocol/protein-stuff/iptg-induction/

· Graslund et al., Nature Methods, 2008, 5(4), 369.

· Rabinovsky et al., J. Neurosci. Res., 1994, 38(2), 127–133.

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