一、概述与原理

GST（Glutathione S-transferase）标签是一种常用的融合标签，分子量约26 kDa，具有良好水溶性，常用于提高疏水或易形成包涵体蛋白的可溶表达。利用固定化还原型谷胱甘肽（GSH）的层析填料，可对GST标签重组蛋白进行特异性亲和纯化。通常情况下，一步GSH亲和纯化得到的GST标签蛋白纯度高于一步Ni²⁺亲和纯化的His标签蛋白。根据表达载体的设计，GST标签可通过PreScission Protease、Thrombin或Factor Xa等特异性蛋白酶切除。

谷胱甘肽亲和填料表面共价偶联还原型GSH，GST标签蛋白通过其天然的谷胱甘肽结合位点与填料上的GSH发生特异性结合，从含有大量杂蛋白的裂解液或培养上清中被选择性捕获，随后通过高浓度GSH或改变pH／离子强度等条件洗脱，实现纯化。

二、材料与试剂

2.1试剂

还原型谷胱甘肽（GSH）

Tris-HCl

氯化钠（NaCl）

DTT（二硫苏糖醇）

NP-40（非离子型去污剂）

Triton X-100

蔗糖

EDTA溶液（如500 mM储备液）

硫酸镁（MgSO₄，如5 mM溶液）

SDS

醋酸盐缓冲液相关试剂（如醋酸钠/醋酸）

20%乙醇溶液

PBS相关盐类

2.2仪器设备

超声波破碎仪或高压均质机

冰浴装置（冰桶或循环冷却系统）

高速冷冻离心机

预装或自装层析柱

蠕动泵或蛋白层析系统（如常规蛋白层析系统）

pH计

紫外分光光度计（可用于检测A280或A260/280）

SDS-PAGE电泳系统及成像系统

三、样品制备流程

1.大肠杆菌细胞质中可溶GST标签蛋白的纯化

①将收集的大肠杆菌菌体用平衡Buffer重悬（建议按1 g菌泥加入5–10 mL平衡液的比例）。重悬完全后，如菌液较为黏稠，可加入少量核酸酶轻轻混匀，置于冰浴中，使用超声波破碎仪进行细胞破碎。

Tip1：若目标蛋白对蛋白酶较敏感，可在破碎过程中加入蛋白酶抑制剂，如PMSF。

Tip2：可加入少量非离子型去污剂（如NP-40，终浓度不超过总体体积的0.1%），以提高纯化纯度。

②超声破碎结束后，将破碎液置于离心机中，12000×g，4℃离心20 min，收集上清。

③取离心所得上清液上柱，进行后续GST亲和纯化操作。

2.对于分泌表达的GST标签蛋白纯化

①不含GSH组分的培养液：培养液离心去除细胞及杂质后，直接取上清进行上柱纯化。

②含GSH组分的培养液：先加入硫酸铵进行蛋白沉淀，收集蛋白沉淀后用平衡Buffer充分复溶，离心去除不溶物，取上清按照同样的条件进行上柱纯化。

3.对于大肠杆菌细胞周质表达的GST标签蛋白纯化

需预先配制如下溶液：

1）Buffer S：30 mM Tris-HCl，20%蔗糖，pH 8.0

2）500 mM EDTA

3）5 mM MgSO₄

①按菌体湿重计算（以1 g菌体为例），加入80 mL Buffer S，同时加入160 µL 500 mM EDTA，轻轻搅拌混匀，持续搅拌约10 min。

②以8000×g，4℃离心20 min，弃去上清。向沉淀中加入80 mL 5 mM MgSO₄充分重悬，置于冰浴中轻轻搅拌使沉淀溶解后，再次8000×g，4℃离心20 min。

③取离心后的上清进行上柱纯化。

4.对于大肠杆菌表达包涵体GST标签蛋白纯化

①将收集的大肠杆菌菌体用平衡Buffer重悬（可按1 g菌泥加入5–10 mL平衡液的比例）。重悬过程中如菌液较黏稠，可加入少量核酸酶，置于冰浴中，使用超声波破碎仪进行细胞破碎。

②以5000×g，4℃离心20 min，弃去上清。向沉淀中加入与原上清等体积的平衡Buffer充分重悬，再次进行超声波破碎处理以使沉淀尽量分散，随后再次在相同条件下离心。

③向所得沉淀（或蛋白溶液）中加入所需的变性剂，按照适当的复性方法进行蛋白复性处理。复性结束后，将复性液装入透析袋中，对平衡Buffer进行透析，直至体系充分平衡。

④透析后的蛋白溶液经离心去除不溶物，取上清进行上柱纯化。

四、使用层析柱纯化流程

①根据样品中GST标签蛋白的预估总量，结合填料的结合载量，计算所需填料体积，并向层析柱中加入相应体积的填料。

②待填料完全沉降至层析柱底部后，先加入≥3倍填料体积的纯化水对填料进行预平衡，再加入5倍填料体积的平衡Buffer进一步平衡填料。

③取待纯化样品上样，确保样品从进入到流出层析填料的保留时间大于1 min，以利于GST标签蛋白充分结合。

④以10倍填料体积的洗杂Buffer进行洗涤，尽可能去除非特异性结合杂蛋白。

⑤使用洗脱Buffer进行洗脱，并收集洗脱液。建议分管分段收集洗脱液，后续通过检测（如SDS-PAGE、吸光度等）再确定需要保留的目标峰组分。

五、填料的再生流程

对于纯化同一种蛋白，同一批填料可连续使用3次后再进行再生处理；对于纯化不同的GST标签蛋白，需按以下步骤对填料进行再生：

①使用5倍填料体积的再生液Ⅰ（0.1 M Tris-HCl，0.5 M NaCl，0.1% SDS，pH 8.5）进行清洗。

②随后使用5倍填料体积的再生液Ⅱ（0.1 M醋酸盐缓冲液，0.5 M NaCl，0.1% SDS，pH 4.5）进行清洗。

③再用5倍填料体积的纯化水充分清洗，去除残留盐和去污剂。

④使用5倍填料体积的PBS再次清洗，使填料缓冲体系恢复至中性、接近储存条件。

⑤最后加入足量20%乙醇溶液覆盖填料，密闭保存于4℃。

六、FAQ

Q1：为什么GST标签重组蛋白不能与填料结合？

常见原因包括：GST标签未正确表达（可通过质粒测序和anti-GST抗体Western Blotting确认）；破菌时超声过猛导致蛋白变性（建议降低功率、缩短时间或改用酶解破菌）；平衡/洗杂Buffer pH不在6.5–8.0范围内导致结合受阻；样品中含高浓度还原剂如DTT（需降低浓度或停用）；以及上样流速过快致接触时间不足（可适当降低流速）。

Q2：纯化产物含有很多杂蛋白原因是什么？

杂蛋白多往往与破菌、填料用量和蛋白稳定性有关：超声条件过强使GST标签蛋白部分变性，特异性结合下降、非特异吸附增多，需温和破菌；填料用量过多易增加非特异性吸附，应按蛋白载量合理减少填料；目标蛋白发生降解时，小片段与杂蛋白混在一起，建议在破菌时加入蛋白酶抑制剂或使用蛋白酶缺失菌株表达；若GST标签蛋白与杂蛋白形成复合物一同结合，可通过提高洗杂Buffer盐浓度、加入1% Triton X-100或在平衡液中加入5 mM DTT削弱非特异相互作用。

Q3：为什么GST标签蛋白不能被洗脱液洗脱下来？

首先检查洗脱Buffer中GSH浓度是否偏低（必要时逐步升高，最高可至60 mM），以及pH是否过低（可调至约pH 9.0提高洗脱效率）；若盐浓度不足，非特异相互作用偏强，可适当提高NaCl浓度并尝试加入约0.1% Triton X-100；同时注意GSH易被氧化，应尽量使用新鲜配制的洗脱液；若目标蛋白已明显降解，部分碎片可能紧密吸附或构象异常难以洗脱，此时需在破菌和洗杂步骤中加入蛋白酶抑制剂，或采用蛋白酶缺失菌株表达以减少降解。

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