产品描述

用途：用于用2-氨基苯甲酸（2-AA）标记游离聚糖。

描述：试剂盒包含通过还原胺化反应将染料偶联到聚糖的自由还原端的试剂。

染料性质：质量=137，荧光，ex（游离染料）=320nm，ex（聚糖染料共轭物）=360nm，em=420nm。

为了获得最大的检测灵敏度，建议激发波长为360 nm

样品数量：通常，每组标记试剂最多15个单独的分析样品

样品量：每个样品25 pmol至25 nmol聚糖

合适的样品：可以标记任何具有自由还原末端的纯化聚糖。

结构完整性：未检测到唾液酸、岩藻糖、硫酸盐或磷酸盐的损失（<2摩尔%）

标记率：通常>85%（取决于样品）。

标记选择性：基本上是化学计量标记。

储存：室温、黑暗处储存。避免热源、光源和湿气。

处理：确保使用的任何玻璃、塑料制品或溶剂不含糖苷酶和环境碳水化合物。在所有样品处理程序中使用无粉手套，避免受到环境碳水化合物的污染。所有涉及标记试剂的步骤必须在干燥的环境中使用干燥的玻璃器皿和塑料器皿进行。一旦打开单个试剂瓶，应立即使用其内容物，多余的应根据当地安全规则丢弃。

安全性：仅供研究使用。不用于人体或药物使用。

试剂盒内容物
每个标记反应组由以下各一个小瓶组成：

所需的其他试剂和设备

• 加热块、烤箱或类似的干式加热器（不能使用水浴）设置为65℃

• 离心式蒸发器（如Savant、Heto或类似产品）

• 反应瓶（例如聚丙烯微离心瓶）

• 注意：如果进行可选的标记后样品净化，则需要更多试剂
  

标记时间线

还原胺化反应

1.希夫碱形成。

这需要具有自由还原末端的聚糖，该末端在闭环（环状）和开环（非环状）形式之间平衡。染料的伯氨基对无环还原末端残基的羰基碳进行亲核攻击，形成部分稳定的希夫碱。

2.希夫碱的减少。

希夫碱亚胺基团被化学还原，得到稳定的标记聚糖。

图1：通过还原胺化用2-氨基苯甲酸（2-AA）标记聚糖。

标记过程概述

聚糖标记试剂盒设计用于聚糖自由还原端的荧光团或生色团标记。然后，在各种色谱和结构序列分析期间，可以对标记的聚糖进行高灵敏度荧光检测或通过UV吸收监测。其中包括HPLC柱色谱法和使用外糖苷酶的测序。

标记过程概述如下：

1.准备聚糖。通过去除可能干扰标签程序的污染物（如盐和洗涤剂）来制备聚糖样品。

2.干燥聚糖

将样品放入反应瓶中并干燥。

3.准备标记试剂

通过混合试剂盒中的试剂制备新鲜的染料标签溶液。

4.向聚糖中添加标记试剂

在每个样品中加入少量的标签溶液。

5.孵化

培养样品，使标记反应进行。

6.标记后提纯

孵育后，如果需要（取决于后续分析程序），使用简单的清理程序去除多余的标记试剂。

7.储存或分析标记的聚糖

标记的聚糖可以立刻进行分析。

样品制备

待标记的聚糖样品，无论是纯化的聚糖还是聚糖混合物，都必须含有游离还原末端，不含颗粒和盐，并存在于挥发性溶剂体系（优选纯水）中。

下列物质可能干扰标记反应，必须首先从聚糖样品中去除：

• 非挥发性溶剂

• 非挥发性盐，特别是过渡金属离子

• 洗涤剂

• 染料和染色剂，例如考马斯蓝
  

标准样品制备方案如下：

1.纯化聚糖

如有必要，使用其中一种方法来去除样品中的非碳水化合物污染物。
2.将样品转移至反应瓶

样品量应在100皮摩尔-50纳摩尔的范围内，用于从典型的糖蛋白中获得的聚糖。在之后的HPLC分析中，用单一纯聚糖可以标记和检测低至5皮摩尔的聚糖。适用的反应瓶包括小型聚丙烯微型离心管和PCR工作用管。

3.干燥样品

理论上，应使用离心蒸发器干燥样品。如果无法实现，则可小心使用冷冻干燥（冻干）（尤其要确保样品在小瓶底部干燥至小而致密的质量）。不要将样品置于高温（>28℃）或极端pH下，因为这些条件会导致唾液酸的酸催化损失（高温、低pH）或聚糖还原末端的差向异构化（高pH）。

标记试剂的制备

按以下步骤制备新的标记试剂：

1.制备DMSO乙酸混合物

向DMSO小瓶中加入150μL冰醋酸，并通过移液管混合。小心地敲击或轻击安瓿，将安瓿上半部分的内容物敲下，然后小心地打开安瓿。如果二甲基亚砜冻结，打开前在烘箱或温箱中将小瓶加热至30℃至65℃。

2.添加染料

向2-AA（2-氨基苯甲酸）染料中加入100μL二甲基亚砜乙酸混合物并混合，直至染料溶解。

3.添加还原剂

将溶解的染料加入氰硼氢化钠还原剂中，通过移液管混合，直到还原剂完全溶解，制成最终的标记试剂。如果还原剂难以溶解，则在65℃的培养箱中加热小瓶最多四分钟，或在此温度下放置在温箱中，然后用移液管混合。如果仍然可见未溶解的还原剂，则向小瓶中加入10μL纯水并混合。防止标签试剂暴露在湿气中，并在60分钟内使用。

标记反应

1.向样品中添加标记试剂

向每个干燥的聚糖样品中加入5μL标记试剂，盖住微管，充分混合，然后轻轻敲击，确保标记溶液位于小瓶底部。

2.孵化

将反应小瓶置于65℃的温箱中、砂盘或干燥烘箱中，孵化3小时。孵化必须在干燥的环境中进行。使用烤箱或干式恒温器-请勿使用水浴。样品必须完全溶解在标标记溶液中，才能进行有效的标记。为了促进完全溶解，可以在65℃孵化开始后对样品进行30分钟涡流，然后继续孵化。在大多数情况下，孵化时间可缩短至2小时或延长至4小时，不会显著改变标记反应的结果。

3.离心并冷却

孵化结束后，取出样品，短暂离心微管，然后将其完全冷却至室温。

2AA标记的聚糖分析

2-AA标记的聚糖可以通过多种不同的分析方法进行研究，包括HPLC、凝胶电泳和质谱法。2-AA标记的聚糖混合物可通过多种HPLC（高压液相色谱）方法分离和分析。

酶分析法

许多公司都提供高纯度的测序级酶，如外糖苷酶，适用于N-和O-连接的标记聚糖。在选择糖苷酶时要特别注意，选择与特定应用相匹配的方法。例如，某些酶和酶缓冲液含有某些类型测定的干扰。

质谱和电泳

标记的聚糖也可以通过质谱、电泳和各种类型的光谱学进行分析。

参考文献

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4 LudgerSep High Resolution HPLC Carbohydrate Profiling Guide (Cat # LS-GUIDE-01)

5 Ludger Enzyme Selection Guide (Cat # EZ-GUIDE-01)

6 LudgerClean Glycan Cleanup Guide (Cat # LC-GUIDE-01)

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8 Ludger Technical Note # TN-AA-01: Analysis of 2-AA (2-aminobenzoic acid) labeled glycans

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