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为什么选择此级别
，适用于对基线干扰要求严格的色谱和分析工作流程。
储存与运输
-20°C储存。超低温运输 。请查阅批次 COA 获取详细规格。
质量文档
SDS、COA、产品数据表及规格说明书均可下载。可通过批号查询获取批次 COA。
文献证明
在色谱分析、有机合成和交叉偶联反应领域已被 0 篇同行评审文献引用。
概述
产品组成
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产品简介
基于重组原理的无缝克隆技术，作为新一代的克隆方法，不依赖繁琐的酶切、连接步骤，也不需要末端补平等操作，依据 DNA 片段与线性化载体末端的 15~25 nt 同源序列的重组，可将插入片段克隆至任意线性载体的任意位点，载体自连背景极低，是一种简单、快速、 高效的 DNA 定向克隆技术。 LightNing™ DNA Assembly Mix 无缝克隆试剂盒最快仅需 5 分钟即可完成单片段重组，且阳性率高于 95%。Mix 中添加的辅助因子， 有效提高克隆阳性率；经优化的反应体系，能够一定程度上耐受未纯 化 PCR 产物中含有的杂质。升级版的无缝克隆试剂盒具有更高的阳性率、更好的兼容性。
实验步骤
1. 实验流程概要
设计与相邻片段末端具有重叠序列的扩增引物；准备载体；酶切或反向PCR扩增；50℃反应5~15min；转化感受态
2.线性化克隆载体制备
选择合适的克隆位点，对载体进行线性化，载体的线性化可以通过酶切或反向 PCR 扩增完成。
① 酶切制备 推荐使用 LightNing™ 快速内切酶进行双酶切，使载体线性化完 全，以降低转化背景 ( 假阳性克隆 )；若使用单酶切进行线性化，可以适当延长酶切时间以减少环状质粒残留。 注 1：经双酶切进行线性化的载体无需去磷酸化，经单酶切则需要去磷酸化； 注 2：酶切完成后，应将快速内切酶失活或对目的产物纯化后再用于重组反应。
② 反向 PCR 扩增制备 为减少扩增突变的引入，推荐使用高保真 PCR Mix 进行扩增。推 荐使用预线性化质粒作为模板，以减少环状质粒模板残留对克隆阳性 率的影响。
3. 插入片段 PCR 引物设计 PCR 引物的 5' 端必须包含与其相邻片段（插入片段或载体）末端 同源的 15~25 nt（推荐 18 nt）序列。假如载体为粘性末端，且 3' 端 突出，则引物设计必须包含突出部分；若 5' 端突出，则引物设计可以 包含突出部分，也可以不包含。 插入片段正向扩增引物： 5'—上游载体末端同源序列 + 酶切位点（可选）+ 基因特异性正向 扩增序列— 3' 插入片段反向扩增引物： 3'—基因特异性反向扩增序列 + 酶切位点（可选）+ 下游载体末端 同源序列—5' 注 1：尽量选择无重复序列且 GC 含量均匀的区域进行克隆，当载体克隆位点上下游 25 nt 区域内 GC 含量为 40%~60% 时，重组效率最高；
注 2：本试剂盒所提供的 pUC 19 载体（Ampr ）连接端序列如下：
4. 插入片段的 PCR 扩增 推荐使用高保真 PCR Mix 进行扩增，以减少扩增突变的引入。建 议使用纯化后的 PCR 产物进行无缝克隆反应，若 PCR 产物经琼脂糖 凝胶电泳鉴定为特异性扩增产物，可直接使用，但加样体积不应超过 总反应体积的 20%。
5. 重组反应
① 于冰水浴中配置以下反应体系：
a. 最适载体用量 (ng) = 0.02 × 载体碱基对数，即 0.03 pmol。 b. 插入单片段，最适片段用量（ng）= 0.04 × 片段碱基对数。
注 1：若插入单片段的长度大于载体，则应互换载体与插入片段用量；
注 2：若插入片段的长度小于 200 bp，则插入片段应使用 5 倍载体用量；
注 3：若按上述公式计算得到的用量超过最低 / 最高值，则建议直接按最低 / 最高用 量使用；
注 4：载体片段过长、插入片段过长克隆阳性率均会降低。 重组反应体系配制完成后，用移液枪轻轻吸打混匀各组分，避免 产生气泡，切勿涡旋。
② 将反应体系置于 50℃，反应 5~15 min。 注 1：推荐使用 PCR 仪等温控比较精准的仪器进行反应，反应时间不足或太 长克 隆效率均会降低； 注 2：当载体骨架在 10 kb 以上或插入片段在 4 kb 以上时，建议延长反应时间到 15~30 min； 注 3：50℃反应完成后，建议进行瞬时离心，将反应液收集至管底。
③ 将反应液离心管置于冰上冷却，之后进行转化或者储存于 -20℃。 注 1： -20℃储存的重组产物，建议在 1 周内使用。
6. 重组产物转化 取 5~10 μl 反应液，加入到 100 μl 感受态细胞中，缓慢吸打混 匀，冰上放置 30 min。42℃ 热激 45~60 sec，冰浴 5 min。加 500 μl SOC 或 LB 培养基，37℃ 振荡培养 40~60 min（200 rpm）。将 菌液均匀涂布在含有对应抗生素的平板上，倒置于 37℃ 过夜培养。
注 1：不同感受态细胞最后的克隆阳性率会有所差别，推荐使用转化效率 > 108 CFU/ μg 的感受态细胞；
注 2：菌落数取决于 PCR 产物与线性化载体的数量和纯度；
注 3：阳性对照平板通常生长大量白色单菌落，阴性对照平板只生长很少的菌落。
7. 阳性克隆检测：挑取单菌落至 10 μl ddH2O 中混匀，95℃裂解 10 min 后，取 1 μl 裂解液作为模板，进行菌落 PCR 鉴定，或将单菌落接种至抗性培养 基中培养过夜后，提取质粒进行酶切鉴定。
注 1：菌落 PCR 时建议至少使用一条通用引物，避免假阳性结果；
注 2：必要时可进一步对阳性结果进行测序鉴定。
常见问题
规格
英文名称
LightNing™ DNA Assembly Mix
储存与运输
储存条件
-20°C储存
运输条件
超低温运输
技术文档
高级数据
质检证书（CoA,COO,BSE/TSE 和分析图谱)
C of A & Other Certificates(BSE/TSE, COO):
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溶液计算器
常见问题
本产品应如何储存？
请于?20 °C条件下保存。需冷冻保存以维持规定的有效期。
本产品如何运输？
本产品采用保温箱配冰袋运输。收货后请立即拆包，并按上述储存条件保存。
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试剂盒包含哪些组分？
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