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基本描述
| 英文别名 | Random Mutation Kit | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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| 规格或纯度 | BioReagent, 适用于分子生物学, 无菌 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 稳定性与储存 | Store at 2-8℃ short term (3 months). Store at -20℃ long term (12 months). Avoid freeze/thaw cycle. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 英文名称 | Random Mutagenesis Kit | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 储存温度 | -20°C储存,避免反复冻融 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 运输条件 | 超低温冰袋运输 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 产品介绍 |
随机突变是阐述蛋白质结构和功能之间的关系、改进蛋白质性能的重要工具。随机突变试剂盒基于易错PCR（error-prone PCR）技术，利用 Taq DNA polymerase 不具有 3′→5′校对功能的特性，在特定的反应缓冲体系中，向扩增的目的基因中引入随机突变密码子。带有随机突变的扩增产物通过双酶切，连接到表达载体中构建文库，然后转化入表达宿主中，进行蛋白活性筛选。如果经一次突变反应不能获得满意的结果，可采用连续易错 PCR（sequential error-prone PCR）策略，即将一次 PCR 扩增得到的有用突变基因作为下一次 PCR 扩增的模板，连续反复地进行随机诱变，使每一次获得的突变累积而产生更有意义的突变。本试剂盒包含有优化的 2x Random System、 Enhancer 和Sterile Water 三种组分，使用时只需加入适量的 DNA 模板和合成的两条扩增引物，并用水补足体积，即可进行扩增反应，操作简便快速，大大减少了多次加样可能造成的出错和污染机会。2x Random System 含有优化浓度的 Taq DNA polymerase、dNTPs、反应缓冲液和稳定剂，可最大限度地克服常规易错 PCR 技术中，由于 Taq DNA polymerase 本身的偏爱性造成的以 GC 突变为主的缺点，获得相对均衡的突变谱。碱基突变率可通过适量添加 Enhancer、调整模板 DNA 量和改变 PCR 扩增循环数进行控制。 产品组分表
下表列出以 10 ng 质粒 DNA 为模板，PCR 扩增一条 1 kb DNA 片段（20 个循环）后测序检测得到的突变率结果。需要注意的是，由于不同 DNA 模板的碱基组成不同、长度不一，以及不同引物的扩增效率存在差异，所以即使在相同的 PCR 反应条件下，两组 PCR 产物所得到的突变率也可能不同。因此我们建议根据实验的具体要求，首先进行多个小体系（20 μl）扩增预实验，分别加入不同体积的 Enhancer（如 0 μl、1μl、5 μl、10 μl 等），摸索出符合目标突变率的反应条件 后，再放大扩增体系。其他影响突变率的因素见【注意事项】。 以50 µl PCR反应体系为例：
本试剂盒适用于扩增低于 4 kb、GC 含量在 70%以下的目标 DNA 片段。 保存条件 -20℃保存，保质期 12 个月；经常使用，可于 4℃保存，保质期 3 个月。 使用方法 1. 引物设计原则： 1）正、反向扩增引物各一条，长度约 20-45 个碱基，3’端分别与目标突变 DNA 片段的上下游结合； 2）尽量将引物的 GC 含量控制在 40-60%； 3）引物如带有克隆酶切位点，必须添加足够的保护碱基以确保酶切效率；实验证明，引物结合在目标 DNA 片段的酶切位点外侧可提高酶切效率，增加转化的克隆数量。 2. 随机突变反应： 1） PCR 反应体系：向 PCR 薄壁管中依次加入下列试剂
注：突变率可通过改变起始模板浓度和扩增循环数进行控制。起始模板浓度越高，突变率越低；扩增循环数越高，突变率越高。 2） 混匀后短暂离心，放入 PCR 仪。 3） PCR 循环参数的设置：
3. 取 1-5 μl PCR 产物电泳检测条带浓度和特异性。 4. 剩余的 PCR 产物电泳，切胶回收目标 DNA 片段。 5. 酶切、连接、转化到表达宿主菌株中进行筛选。 注意事项 1. 由于不同 DNA 模板的碱基组成不同、长度不一，以及不同引物的扩增效率存在差异，所以即使在相同的 PCR 反应条件下，两组 PCR 产物所得到的突变率也可能不同。因此我们建议根据具体实验要求，首先进行多个小体系（20 μl）扩增预实验，分别加入不同体积的 StarMut Enhancer（如 0 μl、1 μl、5 μl、10 μl 等），通过测序或活性检测等方法，摸索出符合目标突变率的反应条件后，再放大扩增体系。 2. 起始 DNA 模板的浓度对突变率有很大影响，通常可通过提高或降低 DNA 模板的浓度来调整突变率。鉴于不同型号的分光光 度计检测的 DNA 浓度存在偏差，DNA 模板最好在酶切线性化后，采用凝胶电泳方法，与已知浓度的线性化双链 DNA 或商品化的 DNA marker 进行对比，确定其浓度。 3. 突变反应产物必须进行切胶回收处理，去除 DNA 模板、PCR 产物上结合的 Taq 酶以及其他杂质。常规的乙醇沉淀、硅胶膜（珠）或玻璃奶吸附等方法，均无法去除结合的 Taq 酶，后者可能遮蔽酶切位点，影响克隆效率。 4. 建立随机突变文库通常需要 10-200 ng/μl （相当于 500 ng -10 μg/50 μl 体系）的 PCR 产物。如遇产量不足，可通过下列方法提高产量： 1） 突变率符合需求时，可放大 PCR 体系，或切胶回收 PCR 产物后，采用常规 PCR 反应条件进行扩增； 2） 突变率低于需求时，提高 PCR 扩增循环数，或切胶回收 PCR 产物后，进行第二轮随机突变反应； 3） 重新设计扩增引物; 4） 降低退火温度； 5） 确保模板质量，采用凝胶电泳方法精确定量。 5. 对于带有克隆酶切位点的 DNA 模板，必须在 PCR 反应结束后，使用 DpnI 完全消化清除甲基化的模板，再切胶回收目标DNA 片段。对于非甲基化的质粒（例如从大肠杆菌 JM110 或 SCS110 菌株中提取的质粒），可通过转化 dam＋ 的大肠杆菌菌株（如 DH5α、TOP10、JM109、XL1-Blue 等），再抽提获得甲基化的质粒作为 PCR 反应模板。 6. 经过双酶切的克隆载体在插入突变 DNA 片段前，应首先通过自身连接检测，确保极低的自连背景。必要时可采用去磷酸化、切胶回收等方法把自连率降至最低，以免影响后续连接反应。 |
名称和识别符
| 分子类型 | 试剂盒 |
|---|
安全和危险性（GHS）
技术规格说明书
质检证书（CoA,COO,BSE/TSE 和分析图谱)
C of A & Other Certificates(BSE/TSE, COO):
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| 批号(Lot Number) | 证书类型 | 日期 | 货号 |
|---|---|---|---|
 ZJ25F0724900 |
分析证书 | 25-07-31 | R1372033 |