产品介绍
血液中的胆固醇约1/3为游离胆固醇，2/3为与脂肪酸结合的胆固醇酯，后者被胆固醇酯酶水解为游离胆固醇。游离胆固醇在胆固醇氧化酶的作用下生成4-胆甾烯酮和过氧化氢。过氧化氢在4-氨基安替吡啉和酚存在时，经过氧化物酶催化，反应生成红色醌类化合物，在510 nm处有吸收峰，其颜色深浅与游离胆固醇含量成正比。
产品组分
T1526198 | 组件 | 物理外观 | 50 T | 100 T | 储存 | 单次测试使用量 |
T1526198A | 酶工作液 | 液体 | 0.4 mL | 0.8 mL | -20℃.避光 | 8 μL |
T1526198B | 显色工作液 | 液体 | 10 mL | 20 mL | -20℃.避光 | 192 μL |
T1526198C | 胆固醇标准品（5 mmol/L） | 液体 | 0.5 mL | 1 mL | -20℃.避光 | 5 μL |
自备仪器和试剂
酶标仪（能测510 nm处的吸光度）、96孔板、低温离心机、匀浆器、异丙醇。
使用方法
1. 样本处理
（1）组织样品：按照组织质量（g）：异丙醇体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1 g组织，加入1 mL异丙醇）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 10 min，取上清置冰上待测。
（2）细菌或细胞样品：按照细胞数量（104个）：异丙醇体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1 mL异丙醇），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声2秒，间隔3秒，总时间3 min）。然后8000 g，4℃，离心10 min，取上清置于冰上待测。
（3）血清（浆）样品：直接测定。
2、样品测定
根据标准孔和样品孔数量配制反应工作液。每孔需要200 μL的反应工作液，包含8 μL酶工作液和192 μL显色工作液。为了避免酶工作液直接接触异丙醇影响反应效果，实验时应预先配制200 μL反应工作液，加样时先加5 μL待测样本，最后加200 μL的反应工作液。按照下表进行样品测定，混匀后37℃孵育30 min，于510 nm测定吸光值。
试剂 | 空白孔（μL） | 标准孔（μL） | 测定孔（μL） |
异丙醇 | 5 | 0 | 0 |
5 mmol/L胆固醇标准品 | 0 | 5 | 0 |
样本 | 0 | 0 | 5 |
反应工作液 | 200 | 200 | 200 |
3. 结果计算
空白孔、测定孔的和标准孔的OD值分别为 A空白 、 A测定 和 A标准 。ΔA测定 = A测定 - A空白 ，ΔA标准 = A标准 - A空白 。带入以下简洁计算公式计算样本中游离胆固醇的含量。
（1）按蛋白浓度计算：
TC含量(μmol/mg prot)=Cₛₜₐₙdₐᵣd × ΔA测定 ÷ ΔA标准 ÷Cpr×n
（2）按样本鲜重计算：
TC 含量(μmol/g)= Cₛₜₐₙdₐᵣd × ΔA测定 ÷ ΔA标准 ÷W× V样总 ×n
（3）按细胞或细菌数量计算：
TC 含量(μmol/10⁴)= Cₛₜₐₙdₐᵣd × ΔA测定 ÷ ΔA标准 ÷N× V样总 ×n
（4）按液体体积计算：
TC 含量(μmol/mL)= Cₛₜₐₙdₐᵣd × ΔA测定 ÷ ΔA标准 ×n
注： Cₛₜₐₙdₐᵣd ：5 μmol/mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL； V样 ：加入反应体系中样本体积，0.005 mL；W：样本鲜重，g； V样总 ：样品制备加入异丙醇的体积，1 mL；N：细胞或细菌数量，以 10⁴ 为单位（例如细胞数量为5×10⁻⁶, N=500）；n：样本稀释倍数。
4. 结果展示
将10 mmol/L胆固醇标准品用异丙醇稀释成以下浓度：10、8、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0 mmol/L 。按照操作步骤进行测定，以胆固醇标准品的浓度(mmol/L)为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。结果如图所示，在0.078-10 mmol/L检测范围内有良好的线性关系。注：本试剂盒只提供5 mmol/L胆固醇标准品，该标曲数据仅供参考。
注意事项
1. 酶工作液冰上解冻，使用前后避免室温放置。
2. 正式检测前，建议选择2-3个预期差异较大的样本进行预实验。
3. 生化检测试剂普遍具有刺激性、生物毒性等，为了您的安全和健康，请在实验全程做好生物安全防护。
ZJ26F0838762
危险品化学品经营许可证（带存储）