ABTS 法是使用最广泛的间接检测方法，可用于亲水性和亲脂性物质抗氧化能力测定。适用于植物组织、红酒等液体样本。其原理是ABTS经氧化后生成稳定的蓝绿色阳离子自由基 ABTS⁺，能溶于水相或酸性乙醇介质中，在 734 nm 处有最大吸收。被测物质加入ABTS⁺溶液后，所含抗氧化成分能 ABTS⁺发生反应而使反应体系褪色。在 734 nm 检测吸光度的变化，并以维生素 C作为对照体系量化抗氧化物质的抗氧化能力。
本试剂盒可采用分光光度检测法，具有检测灵敏度高、线性范围宽、样品用量少等特点。在样品体积为10.0 μL 时，采用分光光度法检测在0.0016-0.1 mg/mL 浓度范围内清除速率有良好的线性关系 。
组分货号 | 组分名称 | 物理外观 | 48T | 96 T | 储存 | 单次测试使用量 |
A1522173A | 提取液 | 液体 | 50.0 mL | 100.0 mL | 2-8 ℃. | 按需 |
A1522173B | 试剂一 | 粉末 | 19.2 mg | 19.2 mg*2 | 2-8 ℃. 避光 | 按需 |
A1522173C | 试剂二 | 粉末 | 3.31 mg | 3.31 mg*2 | 2-8 ℃. 避光 | 按需 |
A1522173D | 维生素C (阳性对照) | 粉末 | 10.0 mg | 10.0 mg | 2-8 ℃. 避光 | 按需 |
自备材料：
酶标仪或可见分光光度计 (能测 734 nm 处的吸光度）、96 孔板、可调节式移液枪及枪头 、 低温离心机、制冰机 、 去离子水、无水乙醇 (可选）、 匀浆器（如果是组织样本）。
使用方法
1.试剂的准备
1) 试剂一：临用前加入5.0 mL蒸馏水 ，溶解后备用。
2) 试剂二： 临用前加入5.0 mL蒸馏水 ，溶解后备用。
3) 工作液配制:临用前将加水溶解后的试剂一和试剂二按照 1:1 比例混合，室温避光放置 12 h-18 h后使用 (试剂 4℃避光可保存三天）；用检测缓冲液 (可选无水乙醇) 稀释 ，推荐稀释25 倍备用 (根据检测仪器进行调节），使空白管吸光度A在 0.6±0.1；
注：工作液最好现配现用，根据所需检测样品计算工作液配置体积。
2. 准备样品
1) 植物样本的制备：称取约 0.1 g 组织，加入 1 mL 提取液进行冰浴匀浆，然后 10,000 g，4℃离心 10 min，取上清， 置于冰上待测。
2) 红酒、果汁等液体样本：吸取 100 μL 样本溶液加入 900 μL 提取液，旋涡振荡混匀，然后 10,000 g，4℃离心 10 min， 取上清，置于冰上待测。
注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。
3. 维生素C (阳性对照) (选做)
1) 维生素C (阳性对照) ：临用前配制；加入 1 mL 去离子水，充分溶解，配制成 10 mg/mL 的维生素 C 溶液，4℃避光可保存两周，用于阳性对照。
2) 阳性对照的准备：若需要线性关系，建议先将 10 mg/mL 维生素C的溶液用去离子水稀释10 倍成 1 mg/mL，然后配制成 0.1、0.05、0.025、0.0125、0.0063、0.0031、0.0016 mg/mL 的维生素 C 溶液待用，稀释可参考下表：
序号 | 维生素C溶液浓度体积 ( µL ) | 去离子水体积 (µL) | 稀释后维生素C浓度 (mg/mL) | 1 | 1.0 mg/mL: 50 µL | 450 | 0.1 | 2 | 0.1 mg/mL: 200 µL | 200 | 0.05 | 3 | 0.05 mg/mL: 200 µL | 200 | 0.025 | 4 | 0.025 mg/mL: 200 µL | 200 | 0.0125 | 5 | 0.0125 mg/mL: 200 µL | 200 | 0.0063 | 6 | 0.0063 mg/mL: 200 µL | 200 | 0.0031 | 7 | 0.0031 mg/mL: 200 µL | 200 | 0.0016 | 8 | - | 200 | 0 |
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4. 样本测定 注意上下标
1) 酶标仪开机预热 30 min 以上，调节波长 734 nm。
2) 加样：按照下表设置空白孔、样本测定孔、阳性对照孔，溶液应按照顺序依次加入。
试剂 (μL) | 测定孔 | 空白孔 | 阳性对照孔(标准孔） |
样本上清 | 10 | - | - |
不同浓度的维生素C 溶液 | - | - | 10 |
去离子水 | - | 10 | - |
工作液 | 180 | 180 | 180 |
充分混匀，室温避光反应 5 min 后测定 734 nm 处吸光值，分别记为 A测定 、 A空白 、 A标准。 |
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注：阳性对照孔和空白孔只需测 1-2 次。不同样本清除 ABTS 自由基的能力可能相差很大，实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果清除率小于 5%，可适当加大样本量，比如加大液体样本体积；如果清除率大于 90%，样本可用提取液进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。
5. 结果计算
1) 阳性对照的自由基清除率计算公式：ABTS 自由基清除率(%)= ( A空白 - A标准 )/A空白× 100%
2) 样本的自由基清除率计算公式： ABTS 自由基清除率 (%)=( A空白 - A测定/ A空白×100%
注意事项
1) 正式测定之前建议选择 2-3 个预期差异较大的样本做预实验。
2) 实验材料应尽量新鲜，当天提取当天测定。
3) 尽量避免使用在碱性条件下呈蓝色或接近蓝色的样本，否则对本试剂盒的检测结果产生干扰。
4) 样品中不宜添加Tween、Triton和NP-40等去垢剂和DTT、巯基乙醇等影响氧化还原反应的还原剂。
5) 不同样本清除ABTS自由基的能力可能相差很大，如果要比较不同样本的ABTS自由基清除能力，建议加入等量的同一批样本进行检测。
6) 样本建议当天提取当天检测。
7) 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
8) 试剂开封后或溶解后请尽快使用，以防影响后续实验效果。
附录1：
参考阳性对照曲线标准曲线如下：在室温条件下按说明书操作，对系列 VC标准工作液 (0.0016-0.1mg/mL) 进行吸光度的测定，以 Vc 标准工作液浓度为横坐标X，以自由基清除率%为Y，建立标准曲线，其数值及标准曲线如下(仅供参考)：
The total antioxidant level is determined by the combined effect of various antioxidants and antioxidant enzymes present in the sample. The ABTS method is one of the most widely used indirect assays for evaluating the antioxidant capacity of both hydrophilic and lipophilic substances. The detection principle of this kit is as follows: ABTS is oxidized to generate a stable blue-green cationic radical, ABTS⁺, which is soluble in aqueous or acidic ethanol media and exhibits maximum absorbance at 734 nm. When a sample containing antioxidants is added to the ABTS⁺ solution, the antioxidants react with ABTS⁺, causing the reaction system to decolorize. The change in absorbance at 734 nm is measured, and VC is used as a control to quantify the antioxidant capacity of the substances.
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