2,7-二氯二氢荧光素（DCFH2）：活性氧（ROS）检测指南
2,7-二氯二氢荧光素（DCFH2）：活性氧（ROS）检测指南
2,7-Dichlorodihydrofluorescein(DCFH2) 是一种可穿透细胞膜的非荧光还原型染料，可被细胞内活性氧（ROS）氧化，生成高荧光产物2,7-二氯荧光素（DCF），是活细胞氧化应激检测中应用最为广泛的探针之一。
- 化学名称
- 2,7-二氯二氢荧光素（DCFH2）
- 产品编号
- D294539
- 荧光产物
- 被活性氧氧化后生成2,7-二氯荧光素（DCF）
- 激发/发射波长
- 激发波长约492–495 nm，发射波长约517–527 nm（DCF）
- 细胞通透性
- 可穿透细胞膜，能自由扩散进入细胞
- 主要应用
- 细胞内活性氧（ROS）检测及氧化应激定量分析
- 检测方式
- 流式细胞术、荧光显微镜、荧光酶标仪
DCFH2是什么？其工作原理如何？
2,7-二氯二氢荧光素（DCFH2）是广为人知的荧光染料2,7-二氯荧光素（DCF）的还原态非荧光前体。DCFH2具有良好的细胞通透性，能被动扩散穿过细胞膜并积聚于细胞质中。进入细胞后（若以二乙酸酯形式DCFH2-DA使用，则经细胞内酯酶水解脱乙酰化），DCFH2被活性氧（ROS）——包括过氧化氢（H₂O₂）、羟自由基及过氧自由基——氧化，生成高荧光产物DCF。
DCF在~492–495 nm激发下，于约517–527 nm处发出绿色荧光，所产生的荧光信号与细胞氧化负荷成正比，便于定量读取。该机制使DCFH2非常适合对多种细胞类型的细胞内氧化应激进行实时定量评估。
DCFH2的关键特性与注意事项
在设计实验时，研究人员应了解DCFH2的以下重要特性与局限性：
- 选择性：DCFH2可响应多种活性氧，包括H₂O₂、羟自由基及某些过氧自由基。通常认为其对超氧阴离子（O₂•⁻）本身的直接敏感性较低，但超氧衍生物种可参与DCF的生成。
- 自氧化：DCFH2在水溶液中及光照条件下易发生自发氧化，导致背景荧光升高。储备液应现配现用，避光保存，并在惰性气氛或低温条件下贮藏。
- 区室化：氧化后的DCF可通过膜转运蛋白从细胞中输出，从而使荧光数据的定量解读更加复杂。
- pH敏感性：DCF荧光具有pH依赖性，实验应在严格控制的生理pH条件下进行，以确保数据的重现性。
- 光敏感性：DCFH2及DCF标记细胞的所有操作均应在尽量减少光照的条件下进行，以避免光诱导氧化伪迹。
尽管存在上述局限，在设置适当对照（包括无染料对照、阳性ROS对照如H₂O₂处理细胞，以及阴性/抗氧化剂对照）的前提下，DCFH2仍是ROS检测的金标准试剂。
实验方案概述：使用DCFH2检测细胞内活性氧
以下概述了使用DCFH2（或其二乙酸酯衍生物DCFH2-DA）通过荧光法测量细胞内ROS的一般实验流程。研究人员应根据具体细胞类型和仪器条件对各参数进行优化。
- 储备液制备：将DCFH2溶于无水DMSO或乙醇，配制浓缩储备液（通常为1–10 mM）。立即分装，避光保存于−20 °C，避免反复冻融。
- 细胞载入：将储备液稀释至工作浓度（通常为5–25 µM），溶于预热的无血清培养基或PBS中。根据细胞类型和摄取效率，于37 °C孵育细胞15–60分钟。
- 洗涤：用预热的PBS洗涤细胞2–3次，去除未被摄取的染料，以降低背景信号。
- ROS诱导/处理：按需施加实验处理（如氧化剂、候选药物、应激因子），并在此阶段设置适当对照。
- 荧光检测：处理结束后立即使用荧光酶标仪（激发~492 nm/发射~527 nm）、流式细胞仪或荧光显微镜检测DCF荧光，以减少自氧化伪迹。
- 数据分析：根据实验设计，将荧光强度归一化至细胞数量、蛋白含量或参考荧光团。
注意：所有操作步骤均应尽量避光进行，强烈建议现用现配工作液。
DCFH2在科学研究中的应用
DCFH2及其二乙酸酯衍生物（DCFH2-DA）被广泛应用于生物医学和生物化学研究的多个领域：
- 氧化应激定量：评估细胞系和原代细胞在生理或病理条件下的基础及刺激性ROS水平。
- 药物筛选与毒理学：评价化合物（包括纳米颗粒、环境毒物和候选药物）的促氧化或抗氧化能力。
- 线粒体ROS研究：结合线粒体靶向策略或抑制剂，DCFH2可提供线粒体氧化代谢相关信息，但明确的亚细胞定位研究更推荐使用区室特异性探针。
- 炎症研究：监测巨噬细胞、中性粒细胞等免疫细胞在激活或刺激后的ROS产生情况。
- 抗氧化剂效能测试：比较抗氧化化合物或酶体系抑制细胞内ROS积累的能力。
- 流式细胞术与高内涵成像：与标准FITC通道兼容，使DCFH2易于应用于多参数流式细胞分析和自动化成像平台。
常见问题
DCFH2与DCFH2-DA有何区别？
DCFH2是探针的游离还原二醇形式，而DCFH2-DA（二乙酸酯）是其乙酰化前药形式，细胞通透性更强，进入细胞后经胞内酯酶水解释放出DCFH2。DCFH2-DA是活细胞检测中更常用的形式。研究人员应根据实验设置和细胞类型选择合适的形式。
DCFH2能特异性检测过氧化氢（H₂O₂）吗？
不，DCFH2并非专一检测H₂O₂的探针。它可响应多种活性氧，包括羟自由基、过氧自由基及其他氧化剂。细胞色素c、过氧化物酶及金属离子也可催化DCFH2氧化为DCF，这可能使结果解读更加复杂。如需更具特异性的H₂O₂检测，研究人员可考虑使用专属探针，如过氧荧光素或硼酸酯类荧光传感器。
DCFH2储备液应如何保存以防止自氧化？
DCFH2储备液应溶于无水DMSO或乙醇中，分装为单次用量，在惰性气体（如氮气或氩气）保护下避光储存于−20 °C，以最大程度减少自氧化。含水工作液应在使用前现配，并在整个实验过程中避光保存。
DCFH2是否兼容流式细胞术？
是的，DCF（DCFH2的氧化荧光产物）非常适合通过标准流式细胞仪的FITC通道进行检测，激发波长约为488 nm，发射检测波长约为525–535 nm。这使DCFH2与大多数多激光流式细胞平台高度兼容，便于在氧化应激多参数分析中与其他细胞标志物联合使用。
参考文献
- Bass DA, Parce JW, Dechatelet LR, Szejda P, Seeds MC, Thomas M. Flow cytometric studies of oxidative product formation by neutrophils: a graded response to membrane stimulation. J Immunol. 1983;130(4):1910-1917.
- Eruslanov E, Kusmartsev S. Identification of ROS using oxidized DCFDA and flow-cytometry. Methods Mol Biol. 2010;594:57-72.
- Halliwell B, Whiteman M. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean? Br J Pharmacol. 2004;142(2):231-255.
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